۳-۲۵-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات ۱۳۸
۳-۲۶-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی ۱۳۹
۳-۲۷- حیوان آزمایشگاهی ۱۳۹
۳-۲۸-ادجوانت‌ فروند ناقص ۱۳۹
۳-۲۹-گروه‌های تجربی و واکسیناسیون موش‌ها ۱۴۰
۳-۳۰- بررسی پاسخ های همورال ۱۴۱
۳-۳۰-۱- بررسی سطح آنتی بادی توتال در رقت های مختلف سرمی ۱۴۲
فصل چهارم: نتایج …………………………………………………………………………………………………….۱۴۴
۴-۱-پیش بینی اپی توپ سلول B 145
۴-۲- قابلیت دسترسی اپی توپ ها ۱۴۹
۴-۳-محل های N-Glycosylated 151
۴-۴-انتخاب اپی توپ ها و اتصال پپتیدها برای تولید ساختمان واکسن ۱۵۳
۴-۵-ارزشیابی توالی پروتئین ۱۵۵
۴-۶-ترجمۀ معکوس ساختمان اول ۱۵۷
۴-۷-نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش SDS-PAGE 159
۴-۸- نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش وسترن بلاتینگ ۱۶۱
۴-۹-نتایج بررسی پاسخ های ایمنی همورال ۱۶۲
۴-۹-۱- نتایج بررسی سطح آنتی‌بادی توتال اختصاصی واکسن کاندید ۱۶۲
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………..۱۶۴
۵-۱- بحث و نتیجه گیری ۱۶۵
۵-۲-پیشنهادات و چشم اندازها ۱۶۸
References …………………………………………………………………………………………………………………………………………………169
ضمائم:
فهرست اشکال :
شکل ۲-۱٫ساختمان ویروس پاپیلوما……………………………………………………………………………………………………………………….۱۶

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت zusa.ir مراجعه نمایید.

شکل ۲-۲٫ نقشه ژنومی در پاپیلوما ویروس……………………………………………………………………………………………………………..۱۸

شکل۲-۳٫نمایی از تکثیر پاپیلوما ویروس در ارتباط با عملکرد پروتئین های غیرساختاری……………………………………………..۱۸
شکل۲-۴٫ مواردی از عفونت پاپیلوما ویروس ها……………………………………………………………………………………………………..۳۰
شکل ۲-۵٫ مراحل اصلی پاپیلوماویروس و محل آنها در اپی تلیوم اسکوآموس…………………………………………………………….۴۱
شکل ۲-۶٫ ساختار شماتیک و توالی ژنی ناحیه بیانی pET-28a(+)…………………………………………………………………………..99
شکل۴-۱٫ نمایش انتخاب اپی توپ ها با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال ، در اینجا ساختمان های پروتئین L1 از سروتایپ های HPV 11, 16, 18, 31, 45 نشان داده شده اند…………………………………………………………………………………۱۵۱
شکل۴-۲٫طراحی اولیه ساختار اپی توپ های منتخب ، E1 تا E10 برای پروتئین L1 و E11 تا E20 برای L2 طراحی شدند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..۱۵۵
شکل ۴-۳٫ آنالیز آنتی ژنی سیتی ساختمان توسط برنامه پروتئان آنالیز ،. این نتایج نشان داد که قسمت های اصلی ساختار پروتئنی جدید خصوصیات هیدروفیلیک دارد، بنابراین توان آنتی ژنیک را دارد……………………………………………………………۱۵۷
شکل۴-۴٫ توالی ترجمه شده معکوس برای بهینه سازی کدون و کدون نادر برای افزایش سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین ارزشیابی شد. به این منظور OPTIMIZER و سرورهای GenScript با هم بکار برده شدند…………………..۱۵۸
ششکل ۴-۵٫ نتایج ترجمه معکوس و بهینه سازی …………………………………………………………………………………………………۱۵۹
شکل ۴-۶٫نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی و مشاهده باند در محدوده ۴۵ کیلو دالتون……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….۱۶۰
شکل۴-۷٫ pET28a(+)/HPV، SDS-PAGE قبل و بعد از تخلیص پروتئین ، نتیجه تخلیص به صورت تک باند و در محدوده ۴۵KD است………………………………………………………………………………………………………………………………………….۱۶۰
شکل۴-۸٫ نتایج Western Blot و SDS-PAGE ، نتیجه در محدوده ۴۵KD است……………………………………………..۱۶۱
شکل۴-۹٫ SDS-PAGE بعد از تخلیص انبوه پروتئین ، نتیجه به صورت تک باند و در محدوده ۴۵KD است…………..۱۶۲
فهرست جداول:
جدول ۲-۱٫ خصویات واکسن چهار ظرفیتی و دوظرفیتی HPV ……………………………………………………………………………….53
جدول ۲-۲٫واکسن های پیشگیری کننده در حال توسعه……………………………………………………………………………………………۶۱
جدول۲-۳٫واکسن های درمانی HPV درحال توسعه………………………………………………………………………………………………..۶۲
ﺟﺪول۲-۴٫ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B ﻣﺨﺘﻠﻒ ……………………………………………………..۷۲
ﺟﺪول ۲-۵٫ ﺗﻌﺪادی از اﺑﺰارهای ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ………………………………………………………….75
ﺟﺪول ۲- ۶ . ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮلB ……………………………………………………………………………80
جدول۳-۱٫ سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV……………………………………..105
جدول۳-۲٫گروه بندی موش های مورد مطالعه………………………………………………………………………………………………………۱۴۱
جدول ۴-۱٫ پیش بینی اپی توپ سروتیپ های HPV 11.16.18, 31, 45 با بهره گرفتن از سرور BCPREDS……………….149
جدول ۴-۲٫فهرست نتایج مدل سازی همولوژی برای پروتئین های L1 از HPV نوع های ۱۱، ۱۶، ۱۸، ۳۱ و ۴۵٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۱۵۰
جدول۴-۳٫ امتیاز و محدوده آسپاراژین در توالی اپی توپ ها را نشان می دهد…………………………………………………………۱۵۳
جدول۴-۴٫ ۲۰ اپی توپ مناسب انتخاب شده از پروتئین های L1 و L2 ………………………………………………………………154
جدول ۴-۵٫ نتایج طراحی پروتئین و محاسبه پارامترهای مربوطه……………………………………………………………………………..۱۵۶
فهرست نمودار ها :
نمودار ۴-۱٫ نتایج بررسی سطح آنتی بادی توتال در گروه های تجربی…………………………………………………………………….۱۶۳

فصل اول
مقدمه

مقدمه:
پاپیلوما ویروس ها، گروهی از ویروس های DNA دار هستند که باعث ایجاد زگیل یا پاپیلوم در انواعی از مهره داران عالی از جمله انسان ها می شوند. همچنین بعضی از پاپیلوما ویروس ها می توانند در حیوانات و انسان ها بدخیمی ایجاد کنند. تعدادی از پاپیلوما ویروس ها به عنوان عوامل ایجاد کننده سرطان گردن رحم و سایر تومورهای اپی تلیال مطرح شده اند (۱). این ویروس ها، ذراتی کروی، کوچک و بدون پوشش با اندازه ای حدود ۵۵ نانومتر هستند که کپسید آنها تقارن بیست وجهی دارد و ژنوم DNA دو رشته ای خطی این ویروس را در بر می گیرد (۶،۵،۴،۳،۲). این ویروس ها کاملا اختصاصی گونه و بافت می باشند و در سلول های اپی تلیال پوست و مخاط تکثیر می شوند و برای ایجاد عفونت پایا باید سلول های بازال را آلوده کنند (۴،۱).
علیرغم تنوعی که در پاپیلوماویروس ها وجود دارد، تشابه بسیار زیادی در سکانس پروتئینی و نوکلئوتیدی اعضای خانواده پاپیلوماویروس وجود دارد و ژنوم های مجزا، سازماندهی ژنتیکی مشابهی دارند (۷). ژنوم این ویروس ها از ۳ ناحیه مجزا تشکیل شده است که شامل ناحیه کنترلی غیر کد کننده ، ناحیه اولیه و ناحیه تاًخیری می باشد. ناحیه کنترلی حاوی توالی های تنظیمی است. ناحیه اولیه شش پروتئین غیر ساختمانی اولیه E1, E2 E4, ,E5, ,E6 ,E7 و ناحیه تاخیری، دو پروتئین کپسیدی L1 و L2 را کد دهی می کند (۹،۸،۱). کپسید ویروس از دو پروتئین ساختمانی تشکیل شده است. پروتئین کپسید اصلی یا L1 دارای وزن مولکولی حدودا ۵۵ کیلو دالتون است که تقریبا ۸۰ درصد کل پروتئین های ویروس را شامل می شود (۱۰). پروتئین کوچک یا L2 تقریبا ۷۰ کیلو دالتون است و در کپسید ویروس جای دارد. ذرات شبه ویروسی یا VLP از پاپیلوما ویروس های مختلف به وسیله بیان ژن L1 به تنهایی یا همراه پروتئین L2 در سیستم های بیان کننده PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران و غیرPESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران تولید شده است (۱۲،۱۱). بیان پروتئین L1 در E.coli باعث تولید ذرات شبه ویروسی کوچک می شود. این ذرات پنتامر ۱۲ تایی بوده و دارای ساختار ۲۰ وجهی هستند. این ذرات شبه ویروسی به خوبی سیستم ایمنی هومورال را تحریک میکنند و بعنوان واکسن پروفیلاکتیک استفاده میشوند (۱۳). پروتئین L2 در تجمع کپسید ویروس نقش دارد و در ضمن دارای اپی توپهای خنثی کننده نیز می باشد. احتمالا وجود پروتئین۲ L در واکسن میتواند از طیف گسترده تری از تیپ های ویروسی پیشگیری کند. هرچند که اپی توپ های خنثی کننده آن شبیه به L1 توانایی حفاظت کنندگی را ندارند اما اپی توپ های آن واکنشهای متقاطع را القا می کنند (۱۴،۱۵،۱۶ و ۱۷).
پروتئین های اولیه E1 و E2 برای تکثیر و باقیماندن ژنوم ویروس مورد نیاز می‌باشند. پاپیلوماویروس های انسانی، پروتئین E3 را ندارند. پروتئین E4 از ناحیه اولیه کد می شود اما در مراحل تاًخیری عفونت بیان شده، باعث گریز ویروس از سلولهای آلوده می گردد (۴،۲). E5 یک پروتئین انکوژن است که رسپتورهای اختصاصی فاکتور رشد را فعال می کند و در ترانسفورمیشن خوش خیم نقش دارد(۲). E6 وE7 انکوپروتئین های اصلی پاپیلوماویروس را کد می کنند. انکوپروتئین E6 مانند پروتئین E1B آدنو ویروس تیپ ۵ و آنتی ژن T بزرگ ویروس SV40 قادر است به پروتئین سرکوب کننده تومور پروتئین های P53 و E6 باعث ممانعت از تعمیر DNA آسیب دیده یا ممانعت از القاء مرگ برنامه‌ریزی شده می گردد و در نهایت باعث تجمع جهش های ژنتیکی درسلول‌های آلوده شده و سلول ها رشد بی رویه ای را آغاز می کنند و سرانجام به صورت سرطانی در می آیند (۱۸).
بیش از ۲۰۰ تیپ پاپیلوما ویروس انسانی شناسایی شده است که تفاوت های ژنومی در توالی های DNA دارند (۱۹،۵) . پاپیلوماویروس های انسانی قادرند سلول های اپی تلیال بازال پوست و دیواره داخلی بافت ها را آلوده کنند و بر این اساس به انواع پوستی و مخاطی طبقه بندی می شوند. انواع مخاطی می توانند دیواره دهان، گلو ، دستگاه تنفس یا اپی تلیوم آنوژنیتال را آلوده نمایند و براساس ارتباط آنها با سرطان گردن رحم و جراحات پیش ساز ، به انواع پر خطر ، با خطرمتوسط و کم خطر تقسیم بندی شده اند (۱، ۲۰ ،۲۱).
سرطان گردن رحم دومین سرطان شایع در زنان جهان است و بروز جهانی آن، سالانه بیش از ۴۰۰۰۰۰ مورد می باشد. حدود ۸۰ درصد موارد سرطان های گردن رحم در کشورهای در حال توسعه اتفاق می افتد . همچنین شیوع انواع HPV ژنیتال و کارسینومای گردن رحم در کشورهای جهان سوم بسیار بالا است (۲۲،۲۳،۲۴). درمان هایی که برای تومورهای پیش بدخیم وجود دارد مانند برداشتن با جراحی یا تخریب آنها با لیزرتراپی یا کرایوتراپی ، ممکن است گاهی اوقات منجر به نازایی شود. از آنجائیکه بیشتر زنانی که تحت تاثیر قرار می گیرند هنوز درسن باروری هستند، روش های درمانی دیگر دردست بررسی می باشند(۲۵).
واکسن های مختلفی برای پیشگیری از عفونت های ویروسی استفاده می شوند. که شامل واکسن های ویروس کشته شده، واکسن های حاوی ویروس زنده تخفیف حدت داده شده، واکسن های پروتئین های خالص شده، واکسن های ویروسی نوترکیب، واکسن های پپتیدی ، واکسن های DNA و … می باشد . در مورد پاپیلوماویروس انسانی به دلیل عدم وجود سیستم های کشت سلول و نیز وجود انکوژن ها در ژنوم این ویروس ها ، استفاده از واکسن های پاپیلوما ویروسی زنده تخفیف حدت داده شده یا ویریون های کامل غیر فعال شده که حاوی DNA ویروسی هستند، محدود شده است(۲۷،۲۶ ).
واکسن های پروتئین های خالص شده و واکسن های پپتیدی نیز روش های تولید و تخلیص نسبتا مشکلی دارند و در مورد واکسن های ویروسی نوترکیب نیز علاوه بر روش تولید و تخلیص مشکل، دارای سیستم های تحویل پیچیده‌ ویروسی هستند. بعلاوه ممکن است پاسخ ایمنی علیه وکتور ویروسی ایجاد شود که باعث ناکارآمدی واکسن می گردد. همچنین بسیاری از واکسن های زیرواحدی قادر به القای لنفوسیت های Tسایتوتوکسیک نمی باشند و به نگهداری در یخچال نیاز دارند و در نهایت واکسن‌هایی که با این روش ها تولید می شوند برای جمعیت عمومی مخصوصا در کشورهای در حال توسعه، گران هستند و نگرانی هایی در مورد سلامت آنها وجود دارد(۲۶،۲۷،۲۸،۲۹).
در این مطالعه سعی بر طراحی نوعی واکسن یونیورسال (universal vaccine) پاپیلومای انسانی شده است البته در تعریف این واکسن میتوان گفت واکسنی است که در آن از اپی توپ های پروتئین های سطحی ارگانیسم های یک خانواده یا مرتبط به هم (در خانواده مجزا) استفاده گردد چنین واکسنی قادر است هم زمان علیه تمام ارگانیسم های مذکور حفاظت ایجاد نمایید(۳۰).
از مزیت های واکسن یونیورسال این است که هزینه ی مصرف کننده را کم می کند و در واقع با یک واکسن بر علیه گونه های مختلفی محافظت ایجاد می کند که باعث کاهش هزینه های شرکت های واکسن سازی نیز می شود. در طی چند سال گذشته واکسن یونیورسال بر ضد ویروس انفلوانزا طراحی شده است که این واکسن یونیورسال به جای اینکه به پروتئین های لایه خارجی ویروس که قابل جهش یافتن و تغییر هستند آسیب برساند به پروتئین های کانال یونی ویروس که در تمام گونه های ویروس انفلوانزا مشترک هستند حمله می کند (۳۱).
در حقیقت در واکسن یونیورسال هدف این است که با بهره گرفتن از یک سری اپی توپهای حفاظت شده بتوان پاسخ ایمنی را بر ضد ویروس اصلی ، زیر نوع های آن ویروس و استرین های جدید از این ویروس القا نمود که به جامعیتی کلی منتهی شود. انتی بادی ها و یا پاسخ ایمنی ضد نواحی نسبتا ثابت پروتئین های سطحی ویروس ها موجب القا پاسخ محافظتی، حتی نسبت به گو نه های نزدیک می گردد که به این فرایند Hetero or Heterosubtypeic immunity اطلاق می گردد. در بررسی های انجام شده بر روی واکسن های انسانی مشخص گردید که در چنین فرایندی هر دو شاخه از ایمنی اختصاصی نقش دارند.(۳۲،۳۳)
بررسی ها نشان می دهد که تا به حال هیچ واکسن یونیورسالی برای ویروسهای پاپیلوما معرفی نشده است با توجه به مزیتهای ذکر شده در این تحقیق برای اولین بار در دنیا یک واکسن یونیورسال برای پاپیلوما بعنوان واکسن کاندید تولید می گردد (۳۴).
. در حال حاضر انکو پروتئین های L1 و L2 پاپیلوما ویروس ، قابل اعتمادترین اهداف به منظور تولید واکسن پیشگیری HPV هستند، زیرا این مولکول ها ، پروتئین های ویروس هستند که باعث اتصال به سلول هدف می شوند. درحقیقت به نظر می رسد وجود این مولکول ها شرط لازم برای اتصال و ورود ویروس به داخل سلول ها باشد (۲۵).
به طور کلی ایمنی هومورال باعث جلوگیری از گسترش ویروس به مکان جدید برای تکثیر و جلوگیری از عفونت مجدد می شود. این عفونت معمولا اختصاصی تیپ است (۳۵). وقتی چندین زگیل به طور همزمان وجود دارد اگر یکی از آنها را برداریم غیر معمول نیست که دیگر زگیل ها پسرفت کنند و این حالت بیانگر آزاد شدن آنتی ژن و شروع پاسخ ایمنی است (۳۶). ناتوانی برای تولید و تهیه مقدار زیادی از ویروس و وجود انکوژن هایی در ویروس باعث گرایش به واکسن های نوترکیب برای این ویروس شده است (۳۶).
همان طور که گفته شد پروتئین های L1 و L2 توانایی خود تجمعی دارند و به شکل VLP به خوبی می توانند باعث القاء سیستم ایمنی هومورال شوند و از عفونت HPV جلوگیری کنند. در واقع اپی توپ های خنثی کننده بر روی این سازه ها وجود دارند و این سازه ها به شکل ذرات تو خالی شبیه ویروس هستند. این ذرات بسیار ایمونوژنیک بوده و تیتر بالایی از آنتی بادی اختصاصی تیپ را القاء می کنند. این ایمنی به صورت دوره طولانی وجود دارد و با انتقال IgG به صورت غیر فعال می تواند نقش حفاظت کننده داشته باشد (۳۷).
در این مطالعه اپی توپ های خنثی کننده L1 و L2 بعد از طراحی، انتخاب و در وکتور بیانی PET-28a بصورت کلون شده تهیه گردید سپس بیان آن مورد ارزیابی قرار گرفت و پس از خالص سازی، به مدل موش آزمایشگاهی تزریق و پاسخ آنتی بادی مورد ارزیابی قرار گرفت.
امروزه واکسن های پیشگیری کننده موثری علیه این ویروس وجود دارد که قیمت بالایی داشته و در حال حاضر جزء برنامه عمومی واکسیناسیون در اغلب کشورها از جمله ایران نمی باشند، بنابراین با توجه به وجود بیماران مبتلا به سرطان ناشی از این ویروس و اینکه تا آینده نزدیک کاهش سرطان ناشی از واکسیناسیون محسوس نخواهد بود، تحقیقات زیادی بر روی واکسن های درمانی این نوع سرطان متمرکز شده اند که برخی از آنها در فازهای مختلف کارآزمایی بالینی می باشند.