۳-۱-۳ تعیین کمیت وکیفیت DNA استخراج شده
۳-۱-۳-۱ ارزیابی کمیت DNA به روش اسپکتروفتومتری
درهنگام کار با دستگاه اسپکتروفتومتری به منظور کالیبره نمودن دستگاه، ۵۰ میکرولیتر آب دوبار تقطیر یا بافر TE به کووت مخصوص دستگاه اضافه کرده و در دستگاه قرارداده و با انتخاب گزینه ی Blank و مشاهده ی عدد صفر، دستگاه کالیبره می شود.در ادامه برای هر نمونه به مقدار ۴۵ میکرولیتر آب مقطر یا بافرTE و ۵ میکرولیتر محلولDNA به درون کووت اضافه شده و پس از قرار گیری در دستگاه و انتخاب گزینه ی Sample میزان جذب نوری محلولDNA در طول موج های مورد نظر و نیز غلظت DNA برحسب میکروگرم بر میلی لیتر نشان داده می شود.هرگاه OD 260 به ۲۸۰ در محدوده ی ۲ـ ۸/۱ باشد، نشان دهنده ی این مطلب است که DNA از خلوص مناسبی جهت استفاده در PCR برخوردار است.بنابراین هر کدام از نمونه ها که مقدار جذب آنها در این محدوده قرار گرفت و دارای غلظت ۱۵۰ نانوگرم بر میکرولیتر و یا بیشتر هستند به عنوان نمونه هایی که استخراج آن ها به درستی انجام گرفته بود، جهت PCR انتخاب شدند.نسبت های کمتر از ۸/۱ نشانگر آلودگی با پروتئین است.
نسبت های بالاتر از ۲ نشان دهنده ی وجود RNA است.بنابراین استخراج نمونه هایی که OD آن ها در محدوده ی مطلوب قرار نداشت، مجدداً انجام گرفت.
۳-۱-۳-۲ارزیابی کیفیتDNA توسط ژل آگارز
در این روش ۳ میکرولیتر از هر نمونه DNA به همراه ۱ میکرولیتر بافر بارگیری در چاهک ژل آگارز ۱% بارگذاری گردید. پس از الکتروقورز با ولتاژ۱۰۰ به مدت۳۰ دقیقه، با توجه به شدت باند حاصل، حجم مناسب از محصول استخراج شده جهتPCR تعیین گردید.DNA استخراج شده از خون جهت آزمایشات بعدی در فریزر۲۰ – نگهداری می شوند.
۳-۱-۴روش الکتروفورز بر روی ژل آگارز
الکتروفورز بر روی ژل، که در سال ۱۹۵۰ توسط اولیور اسمیت[۲۱] ابداع شد، به مجموعه تکنیک هایی اطلاق
می شود، که با بهره گرفتن از ویژگی های فیزیکی نظیر اندازه، شکل یا نقطه ایزوالکتریک یک ملکول، اقدام به جداسازی آن می نماید.این تکنیک در واقع نوعی کروماتوگرافی جامد افقی تسهیل شده توسط نیروی الکتریکی بر روی شبکه ایجاد شده در بستری از جنس آگارز[۲۲] یا پلی‌اکریل آمید[۲۳] است، که به منظور بررسی های کیفی پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک بکار می رود.کاربرد معمول این تکنیک در بررسی های آنالیزی است، اما می توان از آن بعنوان یک تکنیک مکمل برای خالص سازی اختصاصی یک ملکول هم یاد کرد. وجه تسمیه “ژل” در بخش اول نام تکنیک ماتریکس مورد استفاده برای جداسازی ملکول مد نظر است. ژل مورد استفاده در این تکنیک در اغلب موارد پلیمر متخلخلی است که ترکیب و ضریب تخلخل آن بر مبنای نوع و وزن ملکول مد نظر انتخاب می شود.برای جداسازی ملکول های پروتئین و اسید نوکلئیک های کوچک، معمولاً از ژل پلی آکریل آمید استفاده می شود؛ که در واقع ترکیب غلظت خاصی از آکریل آمید به همراه یک رابط است.آگارز خالص استخراج شده از جلبک قرمز، ترکیب کاندید جداسازی ملکول های اسید نوکلئیکی بزرگتر از چند صد باز است.
بخش دوم نام تکنیک یا “الکتروفورز” در واقع به نیروی الکتروموتیوی اشاره می کند که برای حرکت دادن ملکول در درون ژل مورد استفاده قرار می گیرد.مسیر حرکت ملکول های اسیدنوکلئیکی؛ چه RNA چه DNA، در یک میدان الکتریکی بدلیل داشتن بار الکتریکی منفی از قطب منفی به سمت قطب مثبت است. اساس متد معمول به کار رفته برای جداسازی ملکول های اسید نوکلئیکی بر مبنای شکل و اندازه ملکولی آنها می باشد، بنابراین هرچه مولکول‌های اسید نوکلئیکی کوچک‌تر و فشرده تر باشند، سریع‌تر می‌توانند درون ژل مهاجرت کنند.
۳-۱-۳ روش تهیه محلول ها
۳-۱-۳-۱ روش تهیه محلول Tris HCL
Tris-HCL در استخراج DNA ودربافرلیز کننده سلول ها به کار می رود.وزن مولکولی این ماده ۱۴/۲۱ گرم برمول است (M=121/14).بنابراین برای ساخت محلول ۵/۰ مولار ۵۷/ ۶۰ گرم از Tris در ۸۰۰ میلی لیتر آب دوبار تقطیر استریل حل گردید و پس PH با بهره گرفتن از Hcl غلیظ روی ۸ تنظیم گردید و حجم نهایی به یک لیتر رسانده شد.
۳-۱-۳-۲ روش تهیه اتیلن دی آمینو تترا استیک اسید (EDTA)
EDTA در استخراج DNA و بافر لیز کننده ی سلول ها به کار می رود ـ وزن مولکولی این ماده ۲۴ / ۳۷۲ است.بنابراین برای ساخت محلول ۱۰ میلی مولار، ۷۲/۳ گرم از پودر EDTA در ۸۰۰ میلی لیتر آب دوبار تقطیر حل و سپس با بهره گرفتن از مگنت استریل به خوبی همزده شد تا محلول یکنواخت به دست آید. در حین به هم زدن توسط NaOH، PH محلول روی ۸ تنظیم گردید. با توجه به این که انحلال کامل EDTA در PH=8 روی می دهد، بنابراین اضافه کردن NaoH خود به خود به حل شدن پودر EDTA کمک می کند.پس از این که PH در ۸ تنظیم شد، حجم نهایی به یک لیتر رسانده می شود و محلول حاصل در دمای اتاق نگه داری می شود.
۳-۱-۳-۳ روش تهیه محلول کلرور سدیم ۶ مولار (Nacl 6M)
جهت تهیه ی ۱۰۰ میلی لیتر محلول کلرور سدیم ۶ مولار مقدار ۳۱/ ۵۶۴ گرم Nacl درآب مقطر حل گردید و حجم نهایی به ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد، محلول حاصل در دمای اتاق نگه داری می شود.
۳-۱-۳-۴ روش تهیه تریس اتیلن دی آمین تترااستیک (TE)
TE برای حل کردن DNA و نگهداری طولانی مدت آن استفاده می شود. مواد مورد نیاز تا طبق دستور زیر تا حجم ۱۰۰۰ سی سی در آب مقطر حل و سپس اتوکلاو شود.
Tris 1µ(PH=8)(Merck) ………..۱۰ml
Na2 EDTA(0/5M) .………..۲ml
۳-۱-۳-۵ روش تهیه و TAE0 .5X
Tris Base………………………………………………………………………………… ۱۲۱ gr
Glacial acitic………………………………………………………………………… ۲۸/۵۵ ml
ED TA 0/5……………………………………………………………………………… ۵۰ml
– بافر TAE (Tris-Acetate-EDTA buffer) با pH=7/8 به صورت ۵۰X تهیه و مورد استفاده قرار می گیرد.این بافر برای تهیه ژل آگارز و همچنین به عنوان بافر مورد استفاده در تانک الکتروفورز به کار می رود.
مقادیر داده شده دربالا را آماده کرده و PH محلول را چک می کنیم تا حدود ۸ باشد.سپس حجم نهایی را به ۵۰۰ ml می رسانیم . مجددا PH=8 را چک می کنیم و چون غالبا PH اسیدی است آن را توسط بلور سود (NAOH) تنظیم می کنیم.پس از تهیه محلول، از آن TAE با غلظت ۰٫۵X درست کرده به این ترتیب که ۵ml از TAE 50X را با ۴۵۰Ml آب مقطر به حجم ۵۰۰ml می رسانیم.
۳-۱-۳-۶ روش تهیه loading Buffer
نوع و میزان مواد مورد استفاده برای تهیه ترکیب loading Bufferبه قرار زیر است:

جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت jemo.ir مراجعه نمایید.

Sucrose (40%)………………………..…………………………………………….….… ۴۰ gr
Bromophenol Blue (0.25%)……………………….……………….……………………. ۲٫۵ gr

ترکیب مواد بالا را با بهره گرفتن از آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم. محلول حاصل در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می شود.سپس از محلول حاصل ۵۰۰ ماکرولیتر برداشته به آن ۵۰۰ ماکرولیتر DMSOو۵ ماکرولیتر سایبر گرین وبه میزان بسیار کم(در حد نوک سر سمپلر) برمو فنل بلو اضافه می کنیم سپس محلول حاصل را ورتکس و اسپین می کنیم.

۳-۱-۳-۷روش تهیه SDS ۱۰ درصد

PH محلول حاصل از انحلال ۲۵ گرم SDS در ۱۵۰ میلی لیتر آب دیونیزه استریل را، به کمک سود، به ۲/۷ رسانده، حجم نهایی را با بهره گرفتن ازآب دیونیزه به ۲۵۰ میلی‌لیتر می‌رسانیم.نگهداری محلول حاصل به راحتی در دمای محیط امکان پذیر است.
۳-۱-۳-۸ روش تهیه N-lysis
Tris Hcl…………………………………………………………………………….………..۸۵gr
EDTA……………………………………………………………………………………۱/۸۷ gr
SDS……………………………………………………………………………………………۵gr
حجم نهایی مقادیر تعیین شده مواد مذکور را با بهره گرفتن از آب دیونیزه به ۵۰۰ میلی لیتر می رسانیم.
۳-۱-۳-۹ روش تهیه ژل آگارز
ابتدا Casting plate روی سطحی کاملاً تراز قرار داده و شانه را به موازات یکی از اضلاع آن به گونه ای قرار می دهیم که همه دندانه‌هایش با فاصله یکسان از کف در یک سطح قرار گرفته باشند. استفاده از یک سطح شیب دار در این مرحله موجب ایجاد اختلاف سطح در بخش های مختلف ژل و نهایتاً عدم توزیع یکنواخت نیروی الکتریکی در آن می شود. آنالیز نتیجه نهایی چنین واکنشی به دور از خطا نبوده و قابل اعتماد نیست.
در مرحله بعدی آگارزی را که قبلاً با توجه به درصد ژل موردنظر و اندازه Casting plate، وزن کرده ایم به حجم بافر TAE 0.5x از پیش تهیه شده داخل ارلن می افزاییم. مجموعه را به اندازه ای حرارت می دهیم که تمام بلورهای آگارز موجود در بافر حل شود.محلول یکنواخت شفاف و عاری ازحباب حاصل را مدتی در دمای اتاق قرار می دهیم تا حرارت آن به حدود ۵۵- ۴۵ درجه سانتی‌گراد برسد.آگارز مایع حاصل را به آرامی از یک گوشه به گونه ای داخل‌ Casting plate می ریزیم که کوچک‌ترین حبابی در سطح آن ایجاد نشود. سپس اجازه می‌دهیم تا پلیمریزاسیون کامل ژل در دمای اتاق صورت گرفته و ژل آگارز به طور کامل ببندد. شانه را با احتیاط از درون ژل کاملاً بسته شده خارج کرده، ژل را همراه با قالب به تانک الکتروفورز حاوی مقدار کافی بافر TAE 0.5x تمیز انتقال می‌دهیم. مقدار۶ لاندا از محصول PCR را به همراه ۲ لاندا از لودینگ بافر مخلوط کرده و با سرعت و دقت درون چاهک‌ها تزریق می کنیم.علاوه بر این، در کنار نونه ها، یک چاهک از ژل به ریختن حدود ۶ لاندا از Ladder DNA اختصاص داده شد .در پایان، دستگاه به منبع تغذیه متصل و ولتاژ بر حسب طول قطعات بر روی ۹۵ ولت تنظیم گردید.پس از اتمام کار، دستگاه الکتروفورز خاموش و ژل خارج گردید و برای مشاهده به دستگاه Gel Documentation منتقل شد.
۳-۱-۳-۱۰ طریقه استریل کردن وسایل آزمایشگاهی مورد استفاده
وسائل شیشه های آزمایشگاهی و موادی که بایستی استریل شوند به مدت ۱۵ دقیقه در دمای با فشار ۱۲۰درجه اتمسفر توسط دستگاه اتو کلاو استریل می شوند.
۳-۲ مواد ودستگاه های مورد استفاده
در این فصل مواد مصرفی، تجهیزات و دستگاه ها، روش ها و تکنیک های مورد استفاده در این تحقیق معرفی و مورد بررسی قرار می گیرد.
نام ومشخصات دستگاه ها و مواد مورد استفاده به ترتیب در جداول ۳ـ۱ و ۳ـ۲ آورده شده است.
جدول ۳ـ۱: دستگاه های مورد استفاده

حق انحصاری © 2021 مطالب علمی گلچین شده. کلیه حقوق محف