۳-۷-اندازه ­گیری سرولوپلاسمین سرم
سرولوپلاسمین سرم به روش ساندرمن و نوموتو ۱۹۷۰ با سنجش فعالیت اکسیدازی آنها اندازه ­گیری شد. سرولوپلاسمین در pH=4.5 می تواند پارافنیلن دی آمین (PPD) را اکسید کند و فراورده ای رنگی ایجاد کند که میزان تولید آن با غلظت سرولوپلاسمین در سرم یا پلاسما متناسب است. البته مقداری از PPD به روش غیر آنزیمی نیز اکسید می­ شود که از این نظر باید در تخمین مقدار واقعی سرولوپلاسمین تصحیح لازم صورت گیرد. بنابراین سنجش فعالیت اکسیدازی سرولوپلاسمین به طور همزمان یکبار در حضور آزید سدیم و یکبار بدون حضور این ماده انجام می­گیرد. آزید سدیم، اکسیداسیون آنزیمی PPD را مهار می‌کند، به بیانی دیگر از فعالیت سرولوپلاسمین جلوگیری می­ کند و موجب می­ شود که اکسیداسیون غیر آنزیمی PPD ادامه یابد. تفاوت حاصل از شدت جذب نور در این آزمایش با غلظت سرولوپلاسمین متناسب خواهد بود.
مواد :

 

جهت دانلود متن کامل پایان نامه به سایت azarim.ir مراجعه نمایید.

 

استات سدیم (محلول ۰٫۲ مول در لیتر) :

۴/۱۶ گرم استات سدیم با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده می­ شود و این محلول باید در یخچال نگهداری شود.

 

 

اسید استیک (محلول ۲/۰ مول در لیتر) :۱۲ میلی­لیتر اسید استیک با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.

محلول بافر استات (۱/۰ مول در لیتر ، ۴۵/۵=pH در دمایC˚۳۷ ) در یک فلاسک حجمی یک لیتری ، ۴۳۰ میلی لیتر محلول استات سدیم (۲/۰ مول در لیتر ) ، ۷۰ میلی لیتر محلول اسید استیک (۲/۰ مول در لیتر ) و حدود ۴۰۰ میلی­لیترآب مقطر با هم مخلوط شد. محلول در حمام آب گرم تا ۳۷ درجه گرم شد.pH آن با افزودن استات سدیم یا اسید استیک به ۴۵/۵ (بین ۴۰/۵ تا ۵۰/۵) رسید و سپس با آب مقطر به حجم رسانده شد این محلول باید در یخچال نگهداری شود.

سدیم آزید (محلول ۵/۱ مول در لیتر) :۵/۹۷ گرم آزید سدیم با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.

هیدروکسید سدیم (محلول ۱ مول در لیتر ) :۴۰ گرم هیدروکسید سدیم با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.

پارافنیلن دی آمین دی هیدروکلرید۲(C6H4CNH2) محلول بافر ۶/۲۷ میلی مول در لیتر:در یک فلاسک حجمی ۱۰۰ میلی­لیتر، ۵/۰ گرم PPD و حدود ۷۵ میلی لیتر بافر استات (۴۵/۵=pH) که تا ۳۷ گرم شده است. با هم مخلوط می­شوند. pH محلول در دمای ۳۷ با افزودن قطره قطره از محلول هیدروکسید سدیم (۱مول در لیتر) به ۴۵/۵ رسانده می­ شود. سپس محلول با آب مقطر به حجم می رسد. با توجه به اینکه پایداری این محلول تنها ۳ ساعت است، لازم است که دقیقا قبل از مصرف تهیه شود.

روش کار:

 

 

در دو لوله آزمایش که یکی با R (واکنش) و دیگری با B (شاهد) مشخص شد، ۲ میلی­لیتر محلول بافر استات و ۱/۰ میلی­لیتر سرم با هم مخلوط شد.

لوله ها به همراه یک فلاسک حاوی محلول بافر PPD در حمام ۳۷ درجه قرار گرفت تا به تعادل حرارتی برسند.

یک میلی­لیتر از محلول بافر PPD گرم شده به هر یک از لوله ها افزوده شد. سپس لوله­ها دوباره در حمام قرار گرفتند. روی حمام برای جلوگیری از ورود نور پوشانده شد.

پس از ۵ دقیقه، مقدار ۵۰ میکرولیتر آزید سدیم به لوله B افزوده شد و به خوبی مخلوط شده و دوباره در حمام آب گرم قرار گرفت.

پس از ۳۰ دقیقه، ۵۰ میکرو لیتر محلول آزید سدیم به لوله R افزوده شد و مخلوط گردید.

نمونه ها به کوت کوارتز اسپکترفتومتر منتقل شده و جذب نوری آنها در طول موج ۵۵۰ نانومتر قرائت گردید.

نحوه ی محاسبه:
(AR-AB)752/0=غلظت سرولوپلاسمین (گرم در لیتر)
AR=جذب نوری نمونه ی R
AB = جذب نوری نمونه ی B
۳-۸-اندازه ­گیری فریتین
فریتین با روش آنزیمی و کیت اندازه گیری فریتین شرکت بایرکس فارس اندازه گیری شد.
محتویات کیت:

 

 

پلیت: پلیت ۹۶ حفره ای پوشش داده شده با آنتی بادی­های پلی­کلونال ضد فریتین خرگوش

استاندارد صفر: از استاندارد صفر برای رقیق کردن نمونه­ها نیز استفاده می­ شود.

استانداردها: محلول سرم­دار حاوی فریتین انسان در محلول استانداردها از تیمروزال به عنوان نگهدارنده استفاده شده است.

کنترل­های سرمی: حاوی سرم انسانی و تیمروزال.

ردیاب آنزیمی: حاوی آنتی بادی منوکلونال ضد فریتین متصل به پراکسیداز (HRP ) محلول در بافر PBS، حاوی پروتئین و تیمروزال.

بافر رقیق کنننده: حاوی محلول PBS، پروتئین و تیمروزال.

محلول شستشوی غلیظ (ˣ۲۰): حاوی PBS و تیمروزال.

محلول رنگ زا: حاوی بافر H2O2 و TMB.

محلول متوقف کننده واکنش: حاوی H2SO4 دو نرمال.

جمع­آوری و آماده ­سازی نمونه­ها:
نمونه مناسب برای اندازه گیری فریتین، سرم یا پلاسمای هپارینه است. نمونه­ها را تا دو هفته در دمای ۸-۲ درجه سانتی ­گراد می­توان نگهداری کرد. برای نگهداری نمونه­ها به مدت طولانی­تر سرم یا پلاسما را باید در حجم­های کم تقسیم و در ۲۰- درجه­ سانتی ­گراد نگهداری کرد. برای اندازه ­گیری فریتین نمونه­های منجمد شده ابتدا نمونه باید در دمای اتاق ذوب و سپس با حرکت دست یکنواخت کرد. برای یکنواخت کردن نمونه­ها از ورتکس نباید استفاده شود.
روش کار:
قبل از شروع کار دمای تمامی محلول ها به دمای اتاق رسانده شد.
یک حجم محلول شستشوی غلیظ با ۱۹ حجم آب مقطر یا دیونیزه رقیق شد. این محلول تا ۷ روز در دمای ۸-۲ درجه سانتی ­گراد پایدار است.

 

 

ابتدا ۲۵ میلی­لیتر از استانداردها، سرم کنترل­ها و سرم بیماران در حفره­های مربوطه ریخته شد و به آن ۲۰۰ میکرولیتر بافر رقیق کننده اضافه شد، سپس با تکان دادن پلیت، محتویات حفره­ها به مدت ۱۵ ثانیه مخلوط شد.

پلیت به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد.

پیت ۴ بار با ۳۰۰ میکرولیتر محلول شستشو، شستشو داده شد.

به هر حفره ۱۰۰ میکرولیترکونژوگه ضد فریتین (HRP) اضافه شد و ۳۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد.

پیت ۴ بار با ۳۰۰ میکرولیتر محلول شستشو، شستشو داده شد.

به هر حفره ۱۰۰ میکرولیتر سوبسترای TMB اضافه شد.

پلیت به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق و در محل تاریکی قرار داده شد.

۱۰۰ میکرولیتر محلول متوقف کننده واکنش در هر حفره ریخته شد و ۱۰ ثانیه مخلوط شد. میزان جذب نور حفره ها تا ۱۵ دقیقه بعد از افزودن محلول متوقف کننده، در طول موج ۴۵۰ نانومتر خوانده شد.

محاسبه نتایج:
پس از تعیین میزان جذب نوری استانداردها و نمونه­ها و ترسیم منحنی استاندارد غلظت فریتین بر حسب ng/ml محاسبه شد.
۳-۹-اندازه ­گیری آلبومین
آلبومین با بهره گرفتن از کیت شرکت پارس آزمون و به روش BCG اندازه ­گیری شد.
اساس روش:
آلبومین موجود در سرم، اسیدی ایجاد کلمپکس سبز- آبی رنگ می­ کنند که در طول موج ۶۳۰-۵۴۰ نانومتر قابل اندازه ­گیری بوده و شدت رنگ حاصل متناسب با مقدار آلبومین موجود در نمونه است.
AIbumin +BCGAIbumin- BCG(complex)
معرف­ها:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

حق انحصاری © 2021 مطالب علمی گلچین شده. کلیه حقوق مح