به دلیل اینکه ما در این آزمایش به بررسی باکتری های هالوفیل نیز می پردازیم، بنابراین این محیط به NaClنیز نیاز دارد که میزان آن ۱% یعنی معادل ۲۵/۱ گرم می باشد.

در ابتدای کار باید وسایل مورد نیاز برای انجام آزمایش از قبیل لوله آزمایش، ارلن، بشر، مزور، توسط آب و مایع شوینده، آب مقطر، الکل و استون شسته شود. سپس مواد را توسط ترازوی دیجیتال وزن کرده و داخل لوله آزمایش ریخته، به هر کدام ۱۰ میلی لیترآب مقطر اضافه کردیم، هر کدام از لوله ها را داخل ورتکس قرار دادیم تا کاملا حل شد. بعد از آن همه مواد را داخل مزور ریختیم و به میزان ۱ میلی لیتر Trace element، ۱میلی لیتر رزازورین، ۱ میلی لیتر ویتامین به آن اضافه کردیم. تهیه ویتامین باید به صورت کاملا استریل باشد، بنابراین این کار را زیر هود انجام دادیم. به این صورت که ابتدا بیوتین، نیکوتینیک اسید و فولیک اسید را با هم ترکیب کرده، به میزان ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر اضافه کردیم و سپس توسط سرنگ از فیلتر استریل عبور دادیم و در آخر ۱ میلی لیتر از آن را به محلول اضافه کردیم.
pH نهایی این محلول باید ۲/۷ باشد که توسط pHمتر اندازه گیری می شود، اگر pH پایین تر از ۷ بود KOH به آن اضافه می کنیم و اگر pH بالاتر از ۷ بود به آن HCl اضافه می کنیم که در اینجا pH 2/6 بود که به آن OHK اضافه کرده و PH را به ۲/۷ رساندیم. سپس کل محلول را درون ارلن ریختیم. در ادامه به دلیل اینکه کار ما، کار بی هوازی بود، بنابراین باید از گلاوباکس میکروبی استفاده می کردیم ولی به علت عدم دسترسی به گلاوباکس میکروبی، مراحل کشت بی هوازی را انجام دادیم. برای این کار ابتدا ارلن راروی هیتر قرار دادیم تا کاملا حل و شفاف شد. بعد از آن کشت به روش Hungate را انجام دادیم، به این صورت که ابتدا این محلول را داخل ویال ریخته و درپوش آلومینیومی آن را به وسیله کریمپر بستیم تا هوا وارد محیط کشت نشود. بعد از کریمپ کردن هوای داخل ویال را توسط سرنگ خارج کرده و پس از آن گاز _۲N را داخل ویال( Purge )پرچ کردیم. برای این کار از دوسرنگ استفاده کردیم. به این صورت که ابتدا سرنگ اول را داخل ویال قرار داده و سرنگ دوم را که متصل به کپسول است، ابتدا وارد محلول نموده پس از چند ثانیه سرنگ را از محلول خارج کرده و در فضای بالای محلول قرار دادیم تا گاز _۲N در تمامی قسمت های ویال پرچ شود پس از آن سرنگ ها را خارج کردیم. در آخر ویال ها را داخل اتوکلاو قرار دادیم تا کاملا استریل شود، پس از استریل شدن باید نفت استریل را درون ویال ها تلقیح کنیم.
مکانی که برای تلقیح نفت استفاده می کنیم باید کاملا استریل باشدکه این کار را یا زیر هود میکروبی انجام می دهیم یا دو شعله روشن می کنیم و بین این دو شعله نفت را تلقیح می کنیم. به هر ویال حدود ۱ میلی لیتر نفت اضافه کردیم. سپس نمونه ها را به مدت ۱۲۰ ساعت در انکوباتور قرار دادیم. اعمال ذکر شده در تمامی مراحل آزمایش استفاده شد .
سپس محیط کشت نوترینت براث تهیه کردیم، به این صورت که ۱۳ گرم از نوترینت براث را داخل ارلن ریخته، ۲۵/۱ گرمNaCl به آن اضافه کرده و با آب مقطر به حجم ۱۲۵ میلی لیتر رساندیم. سپس مانند مرحله قبل، کشت به روش Hungate را انجام داده و سپس نفت را درون ویال ها تلقیح کردیم در ادامه از محیط کشت نوترینت براث داخل محیط کشت BSM پاساژ کردیم. این مراحل را به منظور غربالگری انجام دادیم.
سپس برای انجام غنی سازی، دوباره محیط کشت BSM تهیه کرده و داخل ویال ریختیم، سپس نفت خام استریل را داخل ویال ها تلقیح کرده و از محیط کشت BSM حاوی نوترینت براث داخل محیط کشت BSM جدید پاساژ کردیم. در ادامه به مدت ۴ الی ۵ روز داخل انکوباتور قرار دادیم و پس از آن لام تهیه کرده و زیر میکروسکوپ مشاهده کردیم.
۳-۴-۳ روش تهیه لام
به مقدار۱ میلی لیتر از محیط کشت برداشته و روی لام ریختیم، سپس گذاشتیم تا کاملا خشک شود، بعد از آن به وسیله شعله فیکس کرده و رنگ آمیزی کردیم.
۳-۴-۴ رنگ آمیزی گرم
برای رنگ آمیزی، ابتدا از رنگ آمیزی گرم استفاده کردیم. به این صورت که ابتدا ۱ قطره کریستال ویوله روی نمونه ریختیم. بعد از گذشت ۱ دقیقه با آب مقطر شست و شو دادیم. در مرحله بعد ۱ قطره لوگل ریخته و بعد از گذشت ۱ دقیقه با آب مقطر شست و شو دادیم. بعد از آن ترکیب الکل و استون را ریخته و با آب مقطر شست وشو دادیم و در آخر سافرانین ریخته و پس از گذشت ۲۰ ثانیه با آب مقطر شست و شو دادیم و منتظر ماندیم تا کاملاٌ خشک شود. بعد از خشک شدن کامل آن زیر میکروسکوپ با عدسی ۴۰ مشاهده کردیم.
۳-۴-۵ رنگ آمیزی منفی
به دلیل اینکه پس از مشاهده میکروسکوپی، نمونه بعضی از سکوها با رنگ آمیزی گرم نا مشخص بود بنابراین از رنگ آمیزی دیگری به نام رنگ آمیزی منفی استفاده کردیم.
برای رنگ آمیزی منفی از مرکب چین استفاده کردیم. روش رنگ آمیزی به صورت زیر می باشد :
ابتدا یک قطره از نمونه را گوشه لام ریخته و سپس یک قطره رنگ مرکب چین روی آن ریختیم، پس از گذشت ۵ دقیقه لام دیگری را به صورت زاویه دار روی لام اول کشیدیم که به این عمل تهیه گسترش
می گویند. پس از اینکه کاملاٌ خشک شد زیر میکروسکوپ مشاهده کردیم.
۳-۴-۶ شناسایی و تخلیص
مرحله بعد، مرحله شناسایی و جداسازی است. برای این مرحله باید محیط کشت اختصاصی تهیه کنیم. محیط کشت اختصاصی محیطBSMبه اضافه _۳KNO می باشد. استفاده از _۳KNOبه این علت می باشد که چون باید در این آزمایش احیای نیترات را انجام دهیم، بنابراین باید از ترکیبی استفاده کنیم که دارای نیترات باشد که _۳KNOدارای نیترات است. در کنار این محیط، محیط کشت MSM نیز برای تکرار آزمایش تهیه کردیم.
محیط کشت BSM را مانند مراحل قبل درست کردیم، به آن _۳KNO اضافه کرده و pHآن را اندازه گیری کرده و به ۷ رساندیم، سپس در ۶ ویال به میزان ۱۴ میلی لیتر ریختیم و بعد از آن به میزان ۱میلی لیترویتامین به هر کدام از ویال ها اضافه کردیم. سپس از محیط نوترینت براث و BSM ای که قبلاٌ نفت را درون آن تلقیح کرده بودیم به درون این ویال ها تلقیح کردیم و به مدت ۱۲۰ ساعت درون انکوباتور قرار دادیم.
در ادامه محیط کشت MSM نیز برای تکرار آزمایش تهیه کردیم. در اینجا نیز به میزان ۲۵/۱ گرم Nacl نیاز داریم که این مقادیر را وزن کرده درون لوله آزمایش ریخته ۱۰ میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه کردیم، سپس روی ورتکس قرار دادیم تا کاملاٌ حل شد. سپس ۱ میلی لیترTrace Element،۱ میلی لیتر ویتامین و ۱ میلی لیتر رزازورین اضافه کردیم. بعد از آن درون ویال ریخته و گاز ازت را داخل آن پرچ کردیم و سپس از محیط های نفتی مراحل قبل به این محیط های MSM جدید تلقیح کردیم.
در مرحله بعد محیط کشت اختصاصی جامد تهیه کردیم، که این محیط همان BSM به همراه _۳KNO است، که به میزان ۵/۱ درصد آگار یعنی ۷۵/۱ گرم به آن اضافه کرده تا به حالت جامد تبدیل شود. قبل از اضافه کردن آگار ۱ گرم گلوکز را در ۱۰ میلی لیتر آب مقطر استریل شده حل کردیم و زیر هود UV از فیلتر عبور دادیم و به ویال ها تزریق کردیم. به دلیل اینکه در این مرحله نفت خام تلقیح نکردیم بنابراین در نمونه کربن نداریم، به همین دلیل از گلوکز به عنوان منبع کربن استفاده کردیم. همچنین از گلوکز برای غنی کردن محیط کشت خود استفاده کردیم.
سپس این محیط را داخل ۸ ویال ریختیم و ویال ها را به صورت شیب دار قرار دادیم تا کاملاٌ خود را ببندد. بعد از گذشت ۱ روز، از محیط کشت نیترات براث به درون محیط کشت آگار تلقیح کردیم و داخل انکوباتور قرار دادیم تا میزان رشد آن را ببینیم. بعد از آن باید محلولی که می خواهیم داخل محیط کشت آگار تلقیح کنیم( BSM + KNO₃ و MSM ) سریال رقت تهیه کنیم. روش تهیه سریال رقت به این صورت می باشد که ابتدا ۹ عدد از ویال های کشت بی هوازی را آماده کردیم و درون هر یک از آن ها ۹ میلی لیتر سرم فیزیولوژیک ریختیم، سپس از محیط کشت BSM+ _۳KNO که قبلاٌ درست کرده بودیم به میزان ۱ میلی لیتر به ویال اول اضافه کردیم و در واقع به میزان ۱/۰ آن را رقیق کردیم. سپس از ویال اول ۱ میلی لیتر برداشتیم و به ویال دوم تلقیح کردیم و این کار را به ترتیب با ۹ ویال دیگر نیز انجام دادیم. سپس همین عمل را با محیط کشت MSM نیز انجام دادیم.
برای انجام کشت از رقت های مختلف استفاده می کنیم که بهتر است از رقت حد وسط یعنی ۱۰^-۵استفاده کنیم. به اندازه ۱/۰ میلی لیتر از این محلول رقیق شده به داخل محیط کشت آگار تلقیح کرده، کشت دادیم و داخل انکوباتور قرار دادیم تا میزان رشد آنها را ببینیم.
۳-۴-۷ تست احیای نیترات
ابتدا ۲۵/۲ گرم پودر نیترات براث را با ۲۵۰ میلی لیتر آب مقطر و ۲۵/۱ گرم NaClمخلوط کردیم و روی حرارت قرار دادیم تا کاملاٌ شفاف شد، سپس در ۴ ویال ۵۰ میلی لیتر به میزان ۲۵ میلی لیتر ریختیم. درپوش آلومینیومی آن را مانند مراحل قبل با کریمپر، کریمپ کردیم. بعد از آن گاز _۲N و CO₂به داخل ویال ها وارد کردیم و در اتوکلاو قرار دادیم تا کاملاٌ استریل شود. سپس از محیط کشت های حاوی باکتری تهیه شده در مراحل قبل داخل ویال ها پاساژ کردیم.
برای تست احیای نیترات به دو معرف نیاز داریم:
محلول آلفا نفتیل آمین ۵% در اسید استیک ۵ نرمال و سولفا نیلیک اسید ۸% در اسید استیک ۵ نرمال.
پس از هر کدام از معرف ها به میزان ۱ میلی لیتر به ویال ها اضافه کردیم و سپس به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۳۸ درجه قرار دادیم.
۳-۴-۸ تست SCHN
تست SCHN برای تجزیه و تحلیل و کاهش میزان کربن، هیدروژن و نیتروژن موجود در نفت و فرآورده های نفتی تصفیه شده به کار می رود.
دستگاه آنالیز عنصری SCHN، دستگاه تمام اتوماتیک و خودکاری است که قادر است به سرعت مقادیر کربن، هیدروژن و نیتروژن را از نمونه های معین تعیین کند. از این دستگاه برای تعیین عناصر موجود در ترکیبات آلی، نفت و مواد استخراج شده از زغال سنگ استفاده می شود.
وزن