شکل ۴-۸-اثر روش استخراج بر مقدار کل ترکیبات فنولیک عصاره ۶۳
 ۶۴
 ۶۴
 ۶۵
 ۶۶
) 67
شکل ۴-۱۴- اثرمتقابل دو متغیر زمان و دما بر روی قدرت پایدارکنندگی ۶۷
شکل ۴-۱۵- اثر متقابل دو متغیر زمان و pH بر روی قدرت پایدارکنندگی ۶۸
شکل ۴-۱۶- اثر متقابل دو متغیر دما و pH بر روی قدرت پایدارکنندگی ۶۸
شکل۴-۱۷-همبستگی مقدار واقعی و مشاهده شده در مورد I.T 69
شکل ۴-۱۸-Desirability for I.T 69
شکل ۴-۱۹- اثر روش استخراج برروی میزان پایداری روغن سویا(شاخص I.T) 70
چکیده
کانون توجهات تحقیقات اخیر، مواد فتوشیمیایی مشتق شده از گیاهان بوده ­اند که ناشی از اثرات مثبت آنها بر سلامتی بشر بوده است. مواد غذایی را درطی فرآوری در کارخانجات می­توان با ترکیبات فعالاز قبیل ترکیبات فنولی که دارای فواید و خصوصیات فیزیولوژیکی از جمله ضدآلرژی، ضدالتهاب، ضدمیکروبی، آنتی‌اکسیدانیو… می­باشند، غنی­سازی نمود. اثرات سودمند موجود در ترکیبات فنولیک به خصوصیت آنتی­اکسیدانی آنها مربوط می­ شود.در این پژوهش، بهینه‌سازی فرایند استخراج ترکیبات فنولیک از عصاره متانولی ۸۰ درصد (حجمی-حجمی) گیاه گلرنگ با نام علمی Carthamustinctorious Lاز خانواده کمپوزیته و یا آستراسه توسط آزمون فولین سیوکالتو انجام گردید. برای بهینه سازی فرایند در آزمون ها ۳ فاکتور زمان (۵،۲۰،۳۵ دقیقه)، دما (۱۵،۳۰و۴۵درجه سانتیگراد) و pH (6،۷و ۸) مورد بررسی قرار گرفت. این طرح از طریق Box-Behnken در ۳ فاکتور و سه سطح که شامل ۱۹ آزمون است انجام شد.در طی آزمون ها مربوط به بهینه سازی فرایند استخراجی که در شرایط (دمای ۴۰ درجه سانتیگراد،زمان ۳۲ دقیقهو۳/۷pH=)انجام شد دارای بیشترین میزان استخراج ترکیبات فنولیک به میزان ۱۶ میلی گرم گالیک اسید (استاندارد ترکیبات فنولیک)به ازای هر ۱ گرم از پودر خشک گیاه ثبت شد. در بررسی نتایج و روند نمودارها در هر دو فرایند، زمان به عنوان موثرترین فاکتور شناسایی شد.

برای بررسی فعالیت آنتی‌اکسیدانی، علاوه بر آزمون فولین، آزمون DPPH و همچنین در ادامه به بررسی قدرت پایدارکنندگی روغن سویا توسط عصاره‌های استحصالی توسط آزمون رنسیمت پرداخته شد.در آزمون‌های مربوط به بهینه‌سازی عصاره‌ای که در شرایط (دمای C˚۳۱، زمان ۴۰ دقیقه و ۹/۶pH=) و (دمای C˚۳۴،زمان ۴۱ دقیقه و ۷= pH) استخراج شدند به ترتیب باmg/ml57/0IC₅₀=وh7/7I.T=، دارای بیشترین قدرت آنتی‌اکسیدانی و قدرت پایدارکنندگی روغن سویا بودند.
فصل اول:مقدمه
۱-۱-مقدمه:
کانون توجهات تحقیقات اخیر، مواد فتوشیمیایی مشتق شده از گیاهان بوده ­اند که ناشی از اثرات مثبت آنها بر سلامتی بشر بوده است. مواد غذایی را درطی فرآوری در کارخانجات می­توان با ترکیبات فعال^[۱] از قبیل ترکیبات فنولی که دارای فواید و خصوصیات فیزیولوژیکی از جمله ضدآلرژی^[۲]، ضدالتهاب^[۳]، ضدمیکروبی^[۴]، آنتی‌اکسیدانی^[۵]و… می­باشند، غنی­سازی نمود. اثرات سودمند موجود در ترکیبات فنولیک^[۶] به خصوصیتآنتی­اکسیدانی آنها مربوط می­ شود (۶۱). تحقیقاتی در سال­های اخیر روی میزان ترکیبات فنولیک موجود در محصولات کشاورزی و پس‌مانده صنعتی آنها و میزان در دسترس بودن این ترکیبات انجام شده است. ترکیبات فنولیک دارای یک یا چند گروه هیدروکسیل متصل به یک حلقه آروماتیک شده می­باشد. اصطلاح فنولیک دسته بسیار بزرگی از ترکیبات را تحت پوشش قرار می­دهد که در دو گروه اصلی، اسیدهای فنولیک^[۷] و فلاونوئیدها^[۸] قرار می­گیرند اسیدهای فنولیک شامل اسیدهایی چون کافئیک^[۹]، گالیک^[۱۰]، پیکوماریک^[۱۱]، الایژیک ^[۱۲]و… هستند.از ترکیبات فلاوونوئیدی می‌توانآپژنین^[۱۳]، لوتئولین^[۱۴]، کوئرسیتین^[۱۵]، ایزورامنتین^[۱۶]، کامپفرول^[۱۷] و… را نام برد. ازنقطه نظر استخراج ترکیبات مؤثره از محصولات کشاورزی و یا پس­مانده­های­صنعتی، میزان استخراج ترکیبات فعالآنها از جمله ترکیبات فنولیک بسیار مهم است و میزان حضور ترکیبات فنولیک در محصولات غذایی به صورت طبیعی و یا غنی‌شده نشان دهنده ارزش غذایی آن محصول در حفظ سلامتی بشر است به همین جهت در فرایند استخراج عواملی چون نوع حلال، نسبت نمونه به حلال، مدت زمان استخراج و دما بسیار مهم هستند. همچنین نحوه عمل استخراج می ­تواند به صورت سنتی از طریق روش­هایی مانند سوکسوله^[۱۸] و غرقابی و یا از طریق فناوری­های جدیدی چون مایکروویو^[۱۹] و یا امواج مافوق صوت^[۲۰] صورت گیرد. تاثیر فرآوری­های جدید در مقایسه با روش­های سنتی از نظر صرفه­جویی در زمان و انرژی و همچنین افزایش بازده استخراج مشخص شده است بررسی نتایج حاصل از تاثیر فاکتورهای مختلف در میزان استخراج با روش اولتراسوند از طریق روش آماری آزمون سطح پاسخ^[۲۱] صورت گیرد چون در این روش آماری با حداقل آزمون انجام شده بیشترین اطلاعات ممکن از روند میزان استخراج به دست خواهد آمدگیاه گلرنگ با نام علمیL Carthamustinctorious از خانواده کمپوزیته و یا آستراسه است. در ایران این گیاه با نام های گلرنگ، کاشفه، چورک و… موسوم است.کشت آن در ایران سابقه طولانی دارد و بیش از ۵۰ رقم از آن شناسایی شده که هر یک بخوبی با شرایط خاص جوی محل خود از قبیل گرم وخشک و کویری و اراضی با غلظت املاح بالا خو گرفته است.لذا با توجه به اهمیت استفاده از ترکیبات فنولیک درسیستم های غذایی و بیولوژیکی و وجود اثرات سرطان زائی در آنتی‌اکسیدان های سنتزی لزوم اهمیت بیشتر به آنتی‌اکسیدان های طبیعی مشخص است در کاربرد آنتی‌اکسیدان های طبیعی، یکی از مشکلات مهم، بازده استخراج از گیاهان و حفظ خواص موثره آنتی اکسیدان­ها است از این رو اهمیت کاربرد فرایندهای استخراج غیر حرارتی،افزایش صرفه جویی در میزان مصرف حلال، زمان و انرژی ودر ضمن بالا بردن میزان بازده استخراج ترکیبات فنولیک کاملا مشهود است.ازآنجا که واریته های گیاه گلرنگ در کشورهای مختلفو شرایط آب و هوایی مختلف رشد می‌‌کند در این تحقیق به عنوان گیاهی که بهینه سازی فرایند استخراج ترکیبات فنولیک آن، به عنوان تجربه‌ای درسایر کشورها، قابل استفاده است، انتخاب شد. اهداف ما در این تحقیق عبارتند از :
الف) بررسی و مقایسه استخراج ترکیبات فنولیک از عصاره گیاه گلرنگ با بهره گرفتن از دو روش اولتراسوند و غرقابی
ب) بررسی اثر همزمان ۳ فاکتور زمان، دما و pH، در طرح Box- Behnken جهت دستیابی به حداکثر اطلاعات در خصوص روند فرایند استخراج ترکیبات فنولیک براساس حداقل دفعات آزمایش
پ) مقایسه نتایج حاصل از آزمون فولین و DPPH جهت تعیین قوی‌ترین عصاره از نظر داشتن ترکیبات فنولیک بیشتر و قابلیت بالای خورندگی رادیکال های آزاد
ت) مقایسه فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره های استخراجی با آنتی اکسیدان تجاری
ث) بررسی و مقایسه پایداری روغن سویا با بهره گرفتن از عصاره گیاه گلرنگ در دو روش غرقابی و اولتراسوند
فصل دوم : کلیات و بررسی منابع
۲- ۱-رادیکال های آزاد و اکسیداسیون روغنها و چربی ها
۲-۱-۱-رادیکال‌های آزاد
رادیکال آزاد عبارت از یک اتم یا ملکول دارای الکترون جفت نشده به صورت آنیونی، کاتیونی یا غیر یونی می‌باشد که می‌تواند به طور مستقل وجود داشته باشد(۷۳). رادیکال‌های آزاد از نظر انرژی ناپایدار، بسیار فعال و با عمر کوتاه هستند بنابراین با حذف یا جفت کردن الکترون های اطرافش یک رادیکال می‌تواند به پایداری برسد. حاصل جدا شدن الکترون از سوبسترا‌های متنوع منجر به ایجاد رادیکال‌های آزاد جدید در محیط می‌گردد(۴۹).
بدین ترتیب حضور یک رادیکال آزاد می‌تواند منشاء یک سری واکنش های زنجیره ای انتقال الکترون شود. مهمترین مکانیسم آسیب رادیکال های آزاد به شرح زیر است:
_تخریب پروتئین ها
_آسیب به اسید نوکلئیک و DNA و ایجاد جهش
_اکسیداسیون باند دوگانه اسیدهای چرب در چربی‌های غشاء و تغییر در ساختمان و فعالیت غشاء(۶۱و۶۰).
۲-۱-۲-پیامدهای پاتولوژیک رادیکال‌های آزاد
رادیکال‌های آزاد به عنوان عامل بسیاری از بیماری‌ها به شمار می‌روند که صدمات بافتی باعث افزایش تولید رادیکال‌های آزاد شده و حضور رادیکال‌های آزاد خود معلول بیماری باشد(۲۱).
در صورتی که تولید رادیکال‌های آزاد به هر دلیلی مانند استرس‌های فیزیکی، مجاورت با اشعه و …افزایش یابد پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء نیز افزایش یافته و باعث اکسیداسیون پروتئین‌ها و مواد ژنتیکی داخل سلولی مثل DNA شده و منجر به اختلالات متابولیک وخیم، واکنش‌های التهابی در عروق محیطی و آترواسکلروز می شود(۶و۲۵).
رادیکال‌های آزاد اکسیژن‌دار به اختصار (OFRS)^[22] نامیده می شوند که قسمتی از گروه بزرگتری به نام (ROS) هستند. گروه ROS علاوه بر رادیکال‌های آزاد اکسیژن‌دار شامل پراکسیدهیدروژن، اسید هیپوکلرو و سایر ترکیبات N-chloramine می‌باشد که این ترکیبات همگی بیشتر از اکسیژن خاصیت اکسیدکنندگی دارند(۶۱).
۲-۱-۳-انواع رادیکال‌های آزاد
۲-۱-۳-۱رادیکال های آزاد اکسیژن‌دار
الف-رادیکال آزاد سوپراکسید :(o^.-₂)
این رادیکال‌ها از احیاء الکترونی اکسیژن تولید می‌شوند و رفتار شیمیایی آن به نوع ماده‌ای که در آن حل می‌شود بستگی دارد به عنوان مثال فعالیت آن در آب کم است این رادیکال در محلول‌های آبی اغلب به عنوان یک ماده احیاکننده عمل می‌کند به طور مثال موجب احیاشدن نمک های‌آهن فریک به فرو می‌شود(۶۱).
ب-رادیکال آزاد هیدروکسیل :(O^.H)
چلات ویژه آهن دو ظرفیتی و مس یک ظرفیتی که قادر به انتقال دادن الکترون به پراکسیدهیدروژن می باشند باعث شکسته شدن باند O-O می‌شود و آنرا به دو جزء آب و رادیکال هیدروکسیل تبدیل می کند (O^_H) یکی از قوی‌ترین اکسیدان های شناخته شده است که می تواند آغازگر فرایندهایی از قبیل لیپد پراکسیداسیون زنجیر DNA و…باشد و هر ملکول ارگانیکی را با اکسیژن ترکیب می کند البته این واکنش پذیری با توکسیسته مترادف نمی‌باشد این رادیکال در اثر قرارگرفتن در برابر اشعه یونیزان هم تولید می‌شود این رادیکال فعالترین رادیکال اکسیژن‌دار شناخته شده است.(۶۱)
(واکنش ۱)H-O-H→ O^.H+H
ج_رادیکال آزاد پراکسی: (ROO^.)
این رادیکال در اثر پراکسیداسیون چربی‌ها و تشکیل ترکیبات پراکسیدی بوجود می‌آید. این رادیکال آزاد در فسفو لیپدهای غشاء در اثر واکنش اکسیداتیو تشکیل می‌گردد(۷۴).
د_رادیکال آزاد نیتریک اکسید: (NO^.)
اکسید نیتریک (NO) و دی اکسید نیتروژن (NO₂) در ساختمان خود الکترون جفت نشده دارند.NO^. در دمای بدن با اکسیژن ترکیب و NO₂ به وجود آورد که قادر به گرفتن اتم‌های هیدروژنی چربی‌های غشاء و آغاز پراکسید شدن چربی‌ها است در ضمن می‌تواند با گرفتن رادیکال سوپراکسید تولید رادیکال هیدروکسید نمایند(۴۶۶۱).
(واکنش ۲)NO^.+O^.-₂→ONOO^-(Peroxynitrite)
(واکنش۳)ONOOH →ONOO^-+H⁺