۱۸٫۲ گرم تریس باز و ۰٫۴ گرم SDS در حدود ۷۰ میلی لیتر آب مقطر حل گشته و با اسید کلریدریک به PH 8.8 رسید. سپس به حجم نهایی ۱۰۰ میلی لیتر رسید.
۳- بافر ژل بالا:
۶٫۱ گرم تریس باز و ۰٫۴ گرم SDS در حدود ۵۰ میلی لیتر آب مقطر حل گشته و با اسید کلریدریک به PH 6.8 رسید.سپس به حجم نهایی ۱۰۰ میلی لیتر رسید.
۴- بافر الکترود:
۳ گرم تریس باز ،۱۴٫۴ گرم گلایسین و ۱ گرم SDS در یک لیتر آب مقطر حل گردید.
۵- بافر نمونه(۵X):
۱۰ میلی لیتر بافر ژل بالا ،۵ میلی لیتر گلیسرول،۱ گرم SDS ،۰٫۲ میلی لیتر محلول برموفنل بلو(۰٫۵ درصد در اتانل ) و یک میلی لیتر ۲-مرکاپتواتانل مخلوط شده و با آب مقطر به حجم ۲۰ میلی لیتر رسیدند.
روش انجام SDS-PAGE :
محلول ژل پایین با غلظت ۱۲٫۵ درصد و ژل بالا با غلظت ۵ درصد بر اساس آماده گردید.
پس از آماده نمودن صفحات شیشه ای و ریختن ژل بالا و پایین ،شانه برداشته شده و آنها به تانک الکتروفورز متصل گردیدند و مخازن تا ارتفاع مناسب با بافر الکترود پر شد. نمونه پروتئین که با بافر نمونه ۵ دقیقه در آب جوش قرار گرفته بود، به وسیله سرنگ هامیلتون در چاهک ها ریخته شدند.
الکتروفورز در ولتاژ ثابت ۱۰۰ ولت انجام گرفت. در پایان ژل با دقت از میان صفحات شیشه ای خارج شده و برای مراحل بعدی آماده می گردد.

 

جهت دانلود متن کامل پایان نامه به سایت azarim.ir مراجعه نمایید.

۳-۱۵- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350

این روش رنگ آمیزی ، ساده ،ارزان و نسبتا حساس می باشد و رنگ برای مدت های طولانی ثابت می ماند.در این روش مراحل ثبوت و رنگ آمیزی پروتئین ها به صورت همزمان انجام می شود.
مواد و وسایل مورد نیاز:

 

 

قرص کوماسی بلو R-350 (فارماسیا)

متانول(مرک)

اسیداستیک(مرک)

ظرف درب دار شیشه ای

آب مقطر

۳-۱۵-۱- روش تهیه محلول ها

 

 

محلول رنگ آمیزی:

یک قرص کوماسی بلو در ۸۰ میلی لیتر آب مقطر و ۱۲۰ میلی لیتر متانول حل و به عنوان محلول استوک نگهداری شد. در هنگام استفاده یک حجم محلول استوک با یک حجم محلول اسیداستیک ۲۰ درصد (در آب مقطر) مخلوط گشت. قبل از استفاده با کاغذ واتمن صاف گردید.

 

 

محلول رنگ بر:

با ترکیب ۲۰۰ میلی لیتر متانول ،۱۰۰ میلی لیتر اسیداستیک گلایسیال و ۷۰۰ میلی لیتر آب مقطر تهیه گردید.

 

۳-۱۵-۲- روش رنگ آمیزی

ژل در ظرف درب دار در حجم۱۰۰ میلی لیتر محلول رنگ ۱-۲ ساعت روی شیکر قرار گرفت. سپس محلول تخلیه و ژل با آب مقطر شستشو داده شده و محلول رنگبر اضافه گردید و روی شیکر قرار گرفت.این عمل چند بار انجام شد تا زمینه شفاف و باندها ظاهر گردیدند.

 

۳-۱۶- وسترن بلاتینگ

در این روش باند های پروتئینی از ژل به غشایی مانند نیتروسلولز منتقل می گردد که قابلیت اتصال و تثبیت پروتئین ها را دارد. برای تشخیص پروتئین های متصل شده به غشا از آنتی بادیها استفاده می گردد.امروزه وسترن بلاتینگ به طور گسترده در تحقیقات و تشخیص به کار می رود.انتقال پروتئینها توسط نیروی الکتریکی در تانک الکتروفورز یا به روش نیمه خشک انجام می‌گیرد.
در این پژوهش به منظور تایید ایمونوژیسیته نمونه HPV واکسن کاندید چند اپی توپی از روش وسترن بلات با انتقال در تانک استفاده شد.

 

۳-۱۶-۱- انتقال در تانک

روش انتقال در تانک به طور معمول در بافر تریس-گلایسین انجام می گیرد. این بافر برای انتقال انواعی از پروتئین ها که به روش SDS-PAGE جدا شده اند،مناسب است.
مواد و وسایل مورد نیاز:

 

 

کاغذ نیتروسلولز

کاغذ واتمن ضخیم

تریس

گلایسین

متانول

آب مقطر

اسفنج

تانک انتقال و ضمائم

منبع نیرو

روش انتقال:
مقداری از بافر انتقال( تریس ۲۵ میلی مولار ،گلایسین ۱۹۲ میلی مولار و متانول ۱۵ درصد به حجم ۲ لیتر در آب مقطر) در ظرفی ریخته شد وژل پس از جدا نمودن بخش متراکم کننده، حداقل ۱۰ دقیقه در آن قرار گرفت . ورقه ای از غشا هم در بافر انتقال قرار گرفت. اسفنجها و کاغذ صافیهای خیس شده روی هم قرار گرفته و ژل هم به آنها اضافه شد. سپس کاغذ نیتروسلولز روی ژل قرار گرفته و کاغذ صافیها و اسفنج به مجموعه اضافه گشت. مجموعه در قالب پلاستیکی محکم شده ، در تانک پر شده با بافر قرار گرفته و در طی شب با ولتاژ ۲۰ ولت الکتروفورز گشت. غشا با روش رنگ آمیزی قابل برگشت پانسو-اس بررسی گردید تا از انتقال اطمینان حاصل گردد.

 

۳-۱۶-۲- مسدودسازی غشا

مناطق آزاد غشا پس از بلاتینگ باید مسدود شوند تا آنتی بادی نشان دار به صورت غیر اختصاصی به آن متصل نگردند و در تشخیص اختلال ایجاد کنند. به این منظور از BSA 1.5 درصد و TWEEN 20 0.05 درصد در بافر TBS استفاده شد. غشا ۱ ساعت در دمای اتاق روی شیکر در این محلول مسدود گردید.

 

۳-۱۶-۳- تشخیص با آنتی بادی

پس از مسدودسازی غشا با آنتی بادی ها و اتصال اختصاصی آنها می توان باند مورد نظر را تشخیص داد. ابتدا آنتی بادی اولیه و سپس به آن آنتی بادی ثانویه کونژوگه با آنزیم متصل می‌شود و محل باند پس از اضافه کردن سوبسترا رنگی و مشخص می گردد.
مواد و وسایل مورد نیاز:

 

 

بافر TBS (تریس ۲۰ میلی مولار وکلریدسدیم ۱۵ مولار در آب مقطر)

بافر TBS-T (Tween20 0.05 درصد در TBS)

آنتی بادی اولیه (anti-Histag)

آنتی بادی ثانویه (آنتی موشی کونژوگه با پراکسیداز سیگما)

DAB (Sigma)

روش آزمایش:
پس از مسدود سازی ، غشا سه بار با TBS-T شسته شده و ۱ ساعت در آنتی بادی اولیه رقت (۱ به ۱۰۰۰) قرار گرفت.
در ادامه غشا ۴ بار شستشو گشته و ۱ ساعت در آنتی بادی ثانویه
(رقت ۱ به ۵۰۰۰( قرار داده شد. سپس ۴ بار شستشو داده شد و به مدت ۱۵ دقیقه در معرض TMB-Blotting قرار گرفت. بعد از ظهور باندها ، غشا با آب مقطر شستشو و پس از خشک شدن در محلی تاریک نگهداری شد.

 

۳-۱۷-تخلیص پروتئین با یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی روی ماتریکس Ni-NTA

از آنجا که پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با دنباله هیستیدینی بیان شده است،تخلیص پروتئین به روش کروماتوگرافی تمایلی انجام می شود.این روند براساس میل ترکیبی بخشی از پروتئین (در اینجا دنباله هیستیدینی) به یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA طراحی شده است. در یک pH بهینه بهترین اتصال بین این دو اتفاق می افتدو بقیه پروتئین ها از ستون خارج می شوند. با شستشوی رزین با ماده ای که بتواند برای اتصال به ماتریکس با پروتئین مورد نظر رقابت کند اتصال پروتئین –ماتریکی سست شده و در نهایت پروتئین مذکور از ستون خارج می شود.شرایط کشت و القاء بیان ، بر روند تولید پروتئین نوترکیب موثر است و از این طریق مستقیما استراتژی به کار گرفته شده برای تخلیص پروتئین را تحت تاثیر قرار می دهد. از طرف دیگر مواردی همچون قدرت یونی pH و حضور یک ماده برای حذف پیوندهای غیر اختصاصی ، در برقراری اتصال بهینه پروتئین-رزین موثر است،لذا توصیه می شود قبل از تلخیص در مقیاس انبوه و جهت کسب شرایط بهینه ،ابتدا تخلیص در مقیاس اندک و به صورت تجربی انجام گیرد.

 

۳-۱۸-بهینه سازی تخلیص

همان گونه که اشاره شد جهت بهینه سازی تخلیص پروتئین HPV غلظت های مختلف ایمیدازول (در بافر لیز کننده)و pHهای مختلف بافرهای تخلیص ودر مقیاس اندک (روشbatch)بررسی گردید و بهترین شرایط برای به دست آوردن بیشترین میزان پروتئین نوترکیب محلول انتخاب شد.

 

۳-۱۹-ارزیابی پروتئین تخلیص شده با روش SDS-PAGE

برای ارزیابی پروتئین تخلیص شده از روشSDS-PAGE وتست برادفورد و اسپکتروفوتومتری بهره گرفته شد. پروتئین‌ها در طول موج ۲۸۰ نانومتر جذب دارند بنایراین جذب نوری با این طول موج برای محلول پروتئین ما خوانده شد.

 

۳-۲۰-تخلیص انبوه پروتئین نوترکیبHPV واکسن کاندید چند اپی توپی

پس از به دست آمدن شرایط بهینه تخلیص، بیان پروتئین در مقیاس بالا انجام شد، سپس خروج پروتئین از سلول به کمک بافر لیزکننده (بافر اتصال حاوی لیزوزیم) و سونیکاتور انجام شد. پروتئین HPV که دارای دنباله هیستیدینی است با روش کروماتوگرافی تمایلی توسط رزین Ni-NTA تخلیص شد.
مواد و وسایل مورد نیاز: