Gonçalves et al., 1998b; Kolattukudy, 1984;
Zoungrana et al., 1997

 

 

Evaluation of the changes in enzyme structure and
protein denaturation indicated by the loss of a
and b structures

 

 

CD

 

 

 

Gonçalves et al., 1999; Petersen et al., 1998;
Zoungrana et al., 1997

 

 

Determination of enzyme denaturation temperatures
™ and enthalpy (DDH) in different conditions

 

 

DSC

 

 

 

Gonçalves et al., 1998a

 

 

Titration of system components to study its interaction
with protein

 

 

ITC

 

 

 

Egmond et al., 1996; Melo et al., 1996a, 1997

 

 

Monitoring of protein unfolding by detection of changes
in tyrosyl ionization

 

 

UV absorbance

 

 

از کالریمتری اسکن دمایی (DSC) و CD و کالیمتری هم دما (ITC) و جذب uv برای توصیف ساختار دوم و سوم کوتیناز و همچنین برای توجیه خواص کاتالیزوری آن و فرایند­های پایداری و دناتوراسیون استفاده شده است. ثابت شده است که DSC یک ابزار مفید به منظور بررسی پایداری حرارتی پروتئین­ها با بهره گرفتن از دمای گذار مرتبط با تغییرات کنفورماسیونی است. با بهره گرفتن از این روش پترسون و همکاران ثبات ساختار سه بعدی کوتیناز در محدودهpH 4تا ۹ را تایید کردند، در صورتی که هیچ فعالیتی درpH 4 تا ۵ مشاهده نشده است. دلیل این رفتار چگونگی یونیزاسیون هیستیدین-۱۸۸ است. این رزیدو به منظور ایجاد ثبات در سرین کاتالیزوری دپروتونه شده است. تیروزین در نزدیکی جایگاه فعال در pH 8.5 در بیان کردن پتانسیل الکتروسترواستاتیک منفی کمک می­ کند ( حداکثر pH فعالیت pH 8.5 است). ثبات بالای کوتیناز قارچی ، در مقادیر pHاسیدی و بازی ،در مقابل کوتیناز گرده که فقط در pH خنثی پایدار است، نشان­دهنده pH بهینه برای فعالیت برابر ۶٫۸ است.
CD اجازه مطالعه ساختار سوم را در محدوده UV نزدیک را می­دهد در حالی که UV دور اجازه ارزیابی تغییرات ساختاری ثانویه در پروتئین را می­دهد. طیف CD از کوتیناز حل شده و جذب شده بر روی SiHG-40 نشان داده است که میزان ساختار مارپیچی به شدت با تماس با سطح سیلیکا کاهش می­یابد. از این رو به نظر می­رسد که نیروی محرکه مهم برای جذب افزایش در انتروپی کنفورماسیونی است.
از ITC نیز استفاده شده تا طبیعت میانکنش­های رخ داده بین سورفاکتانت­ها، الکل­ها و ترکیبات دیگر و اثر آنها بر فولدینگ کوتیناز را مطالعه کنند. اثر pH بر دناتوراسیون کوتیناز به کمک جذب UV در محلول­ها­ی آبی که با تغییرات جذب تیروزین دنبال می­گردد تایید شده است. دمای نقطه میانی منحنی unfolding حرارتی در pH 6/9 بالاتر از pH7/10 است و در نتیجه ناپایداری کوتیناز طبیعی در pH های بالاتر اثبات می­ شود [۵۰].

 

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

عملکرد کوتیناز

مطالعه عملکرد کوتیناز با تعریف ساختار آن مرتبط است و چندین روش به منظور مطالعه عملکرد کوتیناز به کار گرفته شده است (جدول ۲-۱) [۵۱, ۵۲]. این نشان می دهد که در کوتیناز دو پاکت اتصال مختلف ممکن است وجود داشته باشد یکی به استر یا زنجیره کوتاه و دیگری به استر یا زنجیره طولانی تر متصل می­ شود و این امر در مورد الکل ها خواهد بود. با این حال اخیرا مطالعات اشعه ایکس با بهره گرفتن از زنون و کریپتون برای ترسیم حفره آبگریز می توانست تنها یک جایگاه اتصالی منفرد را در سطح کوتیناز آشکار کند که پیشنهاد می­دهد که تعدادی از میانکنش­ها در سطح کوتیناز ممکن است در جایگاه غیر اختصاصی رخ دهد [۵۳]. مطالعه استرئولیپازها در محدوده تری و دی اسیل گلیسرول با بهره گرفتن از تکنیک تک لایه برای تکمیل اطلاعات ساختاری انجام شد [۵۴]. نتایج بدست امده با تری آسیل گلیسرولprochiral نشان داد که کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی یک ترجیح استری مجزا را برای موقعیت sn-3 نمایش می دهد جهش زایی هدفدار به عنوان یک ابزار مهم برای ازمایش و اثبات اثرات میانکنش­های کارکردی کوتیناز با انواع مختلف سوبستراها و تعریف ساختار و به ویژه اتصالات جایگاه فعال استفاده می شود. Manesse و همکاران (۱۹۹۵) از انالوگ های تری گلیسیرید در ارتباط با کوتیناز و جهش یافته های ان همانطور که قبلا اشاره شده بود استفاده کردند[۵۵]. نمونه­های A85F و A85W افزایش فعالیت نشان دادند که نشان ­دهنده میانکنش اثر متقابل بین استر زنجیره اسیل و باقی­مانده­های ۸۰-۹۰ از انزیم می­باشد. جهش برای روشن کردن نقش اسیدهای آمینه در پایدارسازی حدواسط­های پروتئینی مفیداند. جهش سرین-۴۲ با آلانین منجر به کاهش قابل توجهی در فعالیت می شود که نشان­دهنده اهمیت این سرین برای پایداری حفره اکسی انیون است. جهش های N84W و N84D نیز برای مطالعه اثرات فضایی و الکترواستاتیک در کوتیناز ساخته شده است [۴۷]. به منظور بهبود دانش ساختار کوتیناز ، جهش سرین توسط سیستئین انجام شده است [۴۳] که به دلیل دسترسی به سطح و خصوصیت ایزوستریک این جهش، منجر به تشکیل کریستال های می­ شود. اخیرا جهش زایی هدفدار روی بهبود تولید و پایداری کوتیناز تمرکز کرده است.

 

کاربردهای کوتیناز

هیدرولیز باندهای استری از هیدروکسی طبیعی و اپوکسی هیدروکسی اسید­های چرب از کوتین به وسیله کوتیناز Fusarium solani f. sp.pisi strain T8 می توانست در سنتزهای شیمیایی به کار گرفته شود. اسیدهای چرب هیدروکسیل ازاد شده شامل اسیدهای چرب مونو- دی و تری هیدروکسی است که می توانند برای تغییر چربی ها و روغن ها از طریق واکنش اینتراستریفیکاسیون مورد استفاده قرار گیرند [۵۶]. فعالیت کوتیناز بر روی کوتین سیب رقم Delicious cv. Golden آزمایش شد و با فعالیت کوتینازی هشت لیپاز صنعتی از Geotrichum candidum, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, and Pseudomonas sp مقایسه شد. سرعت اولیه هیدرولیز و تبدیل نهایی کوتین سیب با کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی و لیپاز PS-800 تحت شرایط مورد استفاده قابل مقایسه بود [۵۶].
در سال های اخیر فعالیت استرولیزی کوتیناز تا حد زیادی مورد بررسی و استفاده قرار گرفته است. از فعالیت کوتینازی در شرایط زنده سود برده می شود، به منظور استفاده از فعالیت کوتینازی یک منبع آنزیمی حاوی کوتیناز برای افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی کشاورزی است. علاوه بر این کوتیناز می تواند به عنوان رابط بین استراز ها و لیپاز ها مطرح شود که استرهای محلول موثر و تری اسیل گلیسرول های امولوسیون را هیدرولیز می کنند. از مهم­ترین شاخصه­های این آنزیم توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلی استرهای کوچک می­باشد(شکل۲-۸).

شکل ‏۲‑۸ توانایی تجزیه (a) و سنتز(b) ترکیبات پلی استری توسط آنزیم کوتیناز[۵۷]
بنابراین کوتیناز به عنوان یک انزیم لیپولازی در لباسشویی یا ترکیب مواد شوینده ظرفشویی برای حذف چربی ها استفاده می شود[۵۸]. برخی از مزایای کوتیناز زمانی بدست می ­آید که کوتیناز با یک لیپاز تجاری( LipolaseTM ) در حذف تری اسیل گلیسرول در فرایند شستشو مقایسه شود، به عنوان مثال کوتیناز قادر به هیدرولیز چربی در غیاب کلسیم است [۵۸]. کاربردهای بالقوه ان شامل کاربرد ان در صنایع لبنی برای هیدرولیز چربی شیر و در صنعت oleochemistry است. علاوه براین کوتیناز می تواند در ساختار تری اسیل گلیسرید، پلیمرها، سورفاکتانت ها ،محصولات محافظت شخصی، دارو و مواد شیمیایی شامل یک یا چند مرکز کایرال استفاده شود. ترانس استریفیکاسیون چربی ها و روغن ها (stereo) یا استریفیکاسیون های انتخابی الکل­ها را می توان بدست اورد. کاربرد دیگر کوتیناز مربوط به تجزیه پلاستیک است. Polycaprolactone ، پلی استر مصنوعی، توسط کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی(Fusarium solani f. pisi ) به محصولات قابل حل در اب هیدرولیز شده است [۲۴]. در شرایط ازمایشگاهی کوتیناز فعالیت هیدولازی نسبت به تنوع گسترده ای از استرها از استرهای مصنوعی محلول (مانند nitrophenylesters) تا تری گلیسرید با زنجیره بلند نا محلول نشان می دهد (جدول ۲-۲).
جدول ‏۲‑۲ فعالیت هیدرولازی کوتیناز نسبت به تنوع گسترده­ای از سوبستراها [۱۱]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

References Substrates Reaction
Flipsen et al., 1996;Melo et al. 1995a
Goncalves et al.,1995,1996a,b
Zoungrana et al.,1997
Pocalyko et al., 1998
Goncalves et al.,1997
Lamare et al., 1997 Triolein
Tricaprylin
p-Nitrophenyl butyrate
p-Nitrophenyl valerate
p-Nitrophenylpalmitate
Methyl-, ethyl-, propyl propionate Hydrolysis
Tryglycerides
Esters
Sebastiao et al.,1992,1993b
Sarazin et al., 1992,1995
Pinto-Sousa et al., 1992,1995
Melo et al., 1995c
Cunnah et al., 1996;Sereti.1997
Sjursnes et al., 1998
Papadimitriou et al.,1996
Lamare and Legoy, 1995;Lamare et., al,1997
Carvalho et al.,1997b,1998d;Cunnah et al.,1998