۲-۲-۴- عامل بیماری
این بیماری در اثر گونه­ های مختلف Verticiliumمثل V. dahliae، V. albo-atrum، V. tricorpus ، V. nigrescens و V. nubilum ایجاد شده، ولی V. dahliae Kleb گونه غالب بیماری است.
قارچ عامل بیماری خاکزی بوده و تولید اندام­های پایا کرده که باعث ماندگاری و بقای آن در خاک می­ شود. این گونه V. dahliae دارای دو دو سویه برگ­ریز و غیربرگ­ریز است.
۲-۲-۴- ۱- خصوصیات ظاهری V. dahliae
۲-۲-۴- ۱- ۱- کلنی، ریسه، کنیدیوفور و اسپور
عامل بیماری روی محیط کشت­های مختلف رشد می­ کند. خصوصیات ظاهری کلنی در جدایه­های V. dahliae متغیر است (ملکی زیازتی و همکاران، ۱۳۸۶). براساس گزارش عطار (۱۳۸۵) بعضی از جدایه­ها هیف­های خوابیده­ای داشته و میکرواسکلروت­های فراوانی تولید کرده و برخی ریسه­های هوایی فراوان و میکرواسکلروت­های کمی را بوجود می­آورند.
رضوی و همکاران (۱۳۷۷) در بررسی کشت­های تک اسپور دو جدایه برگریز و غیربرگریز قارچ عامل بیماری بر روی PDA، در دمای ۲۵ درجه سانتی ­گراد و تاریکی، نشان دادند که در مواردی کلنی­ها در کشت­های تک اسپور، با جدایه مادری از نظر تولید میزان ریسه هوایی و میکرواسکلروت متفاوت هستند.
گونه­ های مختلف ورتیسیلیوم ریسه­هایی با دیواره عرضی تولید می­ کنند. اکثر سلول­های ریسه تک هسته­ای و هاپلوئید بوده و در دیواره عرضی دارای منفذ مرکزی ساده است. قارچ دارای کنیدیوفورها فراوان، کم و بیش مستقیم، منشعب و شفاف است. کنیدی­ها به صورت مجتمع در یک لعاب موسیلاژی بر روی سلول­های اسپورزای طویل شده به­نام فیالید بوجود می­آیند. فیالیدها بصورت فراهم با ۳-۴ سلول اسپورزا در هر گره بر روی انشعابات هوایی کنیدیوفور تولید می­شوند (شکل ۲-۲). انشعابات ثانویه نیز در بعضی از فیالیدها گزارش گردیده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳).

کنیدی­ها تک سلولی، تخم مرغی تا بیضوی و شفاف هستند. اندازه کنیدی­ها ۳/۱-۲ × ۵/۳-۶ میکرومتر می­باشد (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ عطار، ۱۳۸۵؛ ملکی زیارتی، ۱۳۸۶).
۲-۲-۴- ۱- ۲- میکرواسکلروت
در V. dahliae سلول­های ریسه با تقسیمات متوالی، سلول­های متورم، تقریباً گرد تا بیضوی را بوجود می­آورند که با اضافه شدن ملانین به آن­ها مجموعه ­ای به نام میکرواسکروت را تشکیل می­ دهند (Brown and Wyllie, 1970).
تشکیل شدن میکرواسکلروت در خاک باعث پایداری عامل بیماری می­ شود. میکرواسکلروت­ها به رنگ قهوه­ای تیره تا سیاه، به اشکال مختلف (گرد، بیضی کشیده تا نامنظم) بوده و در اندازه­ های ۱۵-۱۰۰ میکرومتر وجود دارند (رضوی و همکاران، ۱۳۷۷). میکرواسکلروت­های جدایه­های گرگان کروی تا بیضوی کشیده و به اندازه ۳۰-۷۰ میکرومتر گزارش شدند (عطار، ۱۳۸۵؛ ملکی زیارتی، ۱۳۸۶).
تفاوت ریخت شناسی در رابطه با میکرواسکلروت­­ها در جدایه­های این قارچ، به خصوص در گروه ­های سازگار رویشی بیان شده است (Korolev et al., 2000). ابراهیمی و همکاران (۱۳۷۷) نشان دادند که میکرواسکلروت­ها در جدایه­های برگریز کشیده­تر از جدایه­های غیر برگریز می­باشند. در هر میکرواسکلروت تعداد کمی از سلول­ها به­ صورت بی­رنگ (فاقد ملانین) باقی می­مانند که مسئول جوانه زدن میکرواسکلروت هستند (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳).
۲-۲-۴- ۲- نیازهای رشدی در محیط کشت
۲-۲-۴- ۲-۱- دما
دما یکی از مهمترین عوامل محیطی موثر در خصوصیات فیزیولوژیکی قارچ­ها می­باشد. تاکنون تاثیر دما در میزان رشد رویشی، توانایی اسپورزایی، توانایی بیماریزایی و تولید توکسین­های بیماریزای گیاهی در برخی از عوامل بیماریزای گیاهی، ازجمله V. dahliae به اثبات رسیده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ عراقی و همکاران، ۱۳۸۸؛ عطار، ۱۳۸۵؛ Izabella et al., 2007؛ Sanei et al., 2004).
رشد جدایه­های قارچ V. dahliae بسته به نوع جدایه و توان بیماریزایی آن، متفاوت است. بهینه دمای رشدی برای این قارچ از ۲۰-۲۲ درجه سانتی ­گراد برای جدایه های­غیربرگریز تا ۲۷-۲۸ درجه سانتی ­گراد برای جدایه­های برگریز می­باشد (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ عطار، ۱۳۸۵؛ Sanei et al., 2004). البته رشد جدایه­ای از این قارچ در دمای ۳۶ درجه سانتی ­گراد نیز گزارش شده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳). عراقی و همکاران (۱۳۸۹) نشان داد که در مورد جدایه­های V. dahliae بهینه دمای رشدی و تولید میکرواسکلروت برای جدا شده­های پنبه، به ترتیب ۲۵ و ۲۷ و برای دو جدا شده از زیتون و بادام ۲۲ درجه سانتی ­گراد (هم برای رشد وهم تولید میکرواسکلروت) می­باشد. جدایه­های با بیماریزایی بیشتر (مهاجم و برگریز) در دماهای بالاتر، رشد بهتری را از خود نشان می دهند. نتایج مشابهی توسط محققین دیگر گزارش گردید (حمداله زاده، ۱۳۷۲؛ صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ Sanei et al., 2004).

نتایج بررسی اثر دما روی ۸ جدایه زیتون و ۶ جدایه پنبه از باغات و مزارع مختلف استان گلستان نشان داد که الگوی رشدی براساس نوع جدایه و میزان درجه حرارت متفاوت بوده است. بهینه دمای رشدی برای جدایه­های مختلف زیتون ۲۳ یا ۲۵ و برای جدایه­های مختلف پنبه ۲۳، ۲۵ تا ۲۷ درجه سانتی ­گراد گزارش گردید. مقایسه توان رشدی و بیماری­زایی جدایه­ها نشان داد که جدایه­های مهاجم تر بیشترین رشد را در ۲۷ درجه سانتی گراد داشتند (عطار، ۱۳۸۵). از این­رو به نظر می­رسد که توانایی رشد و تولید میکرواسکلروت توسط جدایه­های ورتیسیلیوم به طیف دما بستگی داشته که یکی از مهمترین عامل گسترش اکولوژیکی و بیماریزایی این قارچ باشد.
دامنه حرارتی جوانه زدن اسپورهای V. dahliae حدود ۲۴-۳۰ درجه سانتی ­گراد گزارش شده است. به­علاوه بنظر می­رسد که اسپورهای سوش برگریز برخلاف سوش غیر برگریز در دمای ۳۳ درجه سانتی ­گراد نیز قادر به جوانه زدن می­باشند. نقطه مرگ این قارچ در خاک حدود ۳۰ دقیقه در دمای ۵/۵۷ درجه سانتی ­گراد گزارش شده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ Bollen, 1985).
۲-۲-۴- ۲-۲- اسیدیته^[۶]
رشد این قارچ در اسیدیته بین ۵ تا ۷ به­خوبی انجام گرفته و در صورت کاهش اسیدیته به ۳ یا کمتر، رشد قارچ به شدت کاهش می­یابد. این گونه اسیدیته بالاتر از ۷ )۸-۶/۸( را راحت­تر تحمل می­ کند. رشد قارچ­های عامل پژمردگی ورتیسیلیومی بر روی محیط­های کشت، با تغییر اسیدیته محیط همراه است. البته میزان تغییر به منابع کربن و ازت موجود در محیط بستگی دارد. این تغییر اسیدیته در ضمن رشد قارچ می ­تواند رشد بعدی عامل بیماری را تحت تاثیر قرار دهد. در این ارتباط، رشد ضعیف گونه­ های ورتیسیلیوم بر روی محیط­های غیر بافری شامل نمک­های آلومینیوم یا منابع ازت آلی گزارش شده است. اضافه نمودن کربنات کلسیم به محیط­های کشت با افزایش رشد قارچ همراه است (صانعی وهمکاران، ۱۳۸۳؛ Puhalla and bell, 1981).
اسیدیته بندرت جوانه زدن اسپورهای این قارچ نیز را نیز محدود می­ کند بطوری که اسپورها در دامنه وسیعی از اسیدیته (۴-۹) جوانه می­زنند. اما اسیدیته­های پایین بقاء میکرواسکلروت­ها را در خاک کاهش می­دهد (صفری عربی و همکاران، ۱۳۷۶).
۲-۲-۴- ۲-۳ - نور
میکرواسکلروت­ها در جدایه V. dahliae هم در شرایط نور و هم در تاریکی تولید می­شوند. نور مداوم احتمالاً اسپورزایی قارچ را تحریک می­ کند. البته در یک جدایه اثر نور مداوم با کاهش میزان میکرواسکلروت همراه بوده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳).
مطالعات مربوط به کیفیت نور بر عوامل پژمردگی ورتیسیلیومی نشان داد که نور سبز رشد V. dahliae کم و نور قرمز تولید میکرواسکلروت را افزایش می­دهد. همچنین تولید زهرابه و لیپو-پلی ساکارید در جدایه­های این قارچ که تحت نور قرمز رشد کرده، کاهش یافته و تلقیح این قارچ­ها به گیاه پنبه با کاهش میزان آلودگی همراه است (Akhmedzhanov et al., 1990). نور آبی تولید اسپور را در این قارچ افزایش داده، اما از تولید میکرواسکلروت بطور کامل جلوگیری می­ کند. بررسی­های هوشیارفرد و همکاران (۱۳۷۹) نشان داد که نور ماورای بنفش شدت بیماریزایی جدایه­های V. dahliae را تحت تاثیر قرار می­دهد و موجب القاء بطئی­تر علایم بیماری در گیاه می­گردد.
۲-۲-۴-۳- ژنتیک
۲-۲-۴-۳-۱- گروه ­های سازگار رویشی^[۷]
سازگار رویشی به قابلیت افراد یک استرین برای انجام آناستموز و ایجاد هترکاریون­های پایدار گفته می­ شود. با ایجاد هتروکاریون، جدایه­های مورد نظر در یک گروه سازگار رویشی قرار می­گیرند. سازگاری رویشی همانند سازگاری جنسی توسط یک یا چند محل ژنی کنترل می­ شود. در ساده­ترین سیستم­ها، استرین­هایی که دارای یک­سری محل­های ژنی مشابه­اند، قادر به تشکیل هتروکاریون پایدار خواهند بود (Elena, 2000).
پاپایوآنو و همکاران (Papaioannou et al., 2013) با بهره گرفتن از ناحیه IGS ریبوزومی (ribosomal intergenic spacer) تمایز مولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی گروه ­های سازگار رویشی قارچ V. dahliae را مورد بررسی قرار دادند. آن­ها با مقایسه ۲۰۱ توالی موجود در بانک­های اطلاعاتی، یک زیرناحیه متغیر (حاوی چهار گروه متفاوت از توالی­های تکراری) در این ناحیه IGS را ردیابی کردند. این زیرناحیه برای یک کلکسیون بین المللی از ۵۹ جدایه متعلق به همه VCGهای V. dahliae و ۹ نماینده از V. albo-atrum و V. longisporum تکثیر و تعیین توالی شد. آنالیزهای فیلوژنتیکی این زیرناحیه پلی­مورفیک، تشخیص دو دودمان اصلی در V. dahliae (یکی شامل گروه ­های سازگار رویشی ۱A، ۱B، ۲A، ۴B و ۳ و دیگری شامل گروه های ۲B، ۴A و ۶) را امکان­ پذیر ساخت. آنالیز توالی­های این ناحیه، مناسب بودن آن به عنوان یک ابزار مولکولی برای تمایز سریع بین­ گونه ­ای، تفکیک درون گونه ­ای بین گروه ­های سازگار رویشی V. dahliae و آنالیز فیلوژنتیکی درون و بین گروه ­های سازگار رویشی V. dahliae را ثابت نمود.
یک روش PCR آشیانه­ای مرکب^[۸] برای ردیابی V. dahliae در داخل گیاه کنگرفرنگی و تشخیص گروه ­های سازگار رویشی آن ابداع شد. گروه ­های سازگار رویشی در داخل بافت گیاه بر اساس الگوهای خاص مارکرهای مولکولی تکثیر شده، از یکدیگر تشخیص داده شدند. همچنین این روش در مقایسه با روش­های سنتی دارای حساسیت بسیار بالاتری در ردیابی پاتوژن حتی در گیاهان بدون علایم بود ((Collado-Romero et al., 2009).
در یونان ۲۳ جدایه V. dahliae بدست آمده از پنبه همراه با جدایه­هایی از گوجه فرنگی و هندوانه در گروه VCG2 قرار گرفتند. دو جدایه از گوجه فرنگی در VCG4 و ۹ جدایه فاقد هرگونه مکمل به جدایه­های استاندارد بودند (Ebihara et al., 1997). در مطالعات بعدی ۴۴ جدایه از این قارچ از میزبان­های مختلف در سه گروه VCG2A,B (17 جدایه)، VCG3 (2 جدایه) و VCG4A,B (8 جدایه) قرار گرفتند. در این بررسی ۱۷ جدایه در ارتباط با VCGهای شناخته شده نبودند (Gennari et al., 1997).ریگز و گراهام (Riggs and Graham, 1995) از امریکا دریافتند که جدایه­های V. dahliae از پنبه در VCG1، جدایه­های فلفل و پسته در VCG2 و جدایه­های گوجه فرنگی در VCG3 قرار می­گیرند.
جهت مشخص شدن گروه ­های سازگار رویشی در ورتیسیلیوم در مطالعات سنتی از آگزوتروف­ها، جهش یافته­های سفید و قهوه­ای و جهش یافته­های nit استفاده می­ شود. اکثر گروه ­های سازگار پیشنهاد شده برای عوامل پژمردگی، با بهره گرفتن از جهش یافته­های nit مشخص شده ­اند. مطالعات نراقی و همکاران (۱۳۷۹) یازده گروه سازگار رویشی را در جدایه­های پنبه با بهره گرفتن از جهش یافته­های آگزوتروف مشخص نمود. بررسی­ گروه ­های سازگار رویشی در جدایه­های ایرانی V. dahliae نیز صورت گرفته است. در این مطالعه ۸ گروه سازگار رویشی شامل یک گروه برگریز و ۷ گروه غیر برگریز مشخص شد (عرب سلمانی و بنی هاشمی، ۱۳۷۹).
۲-۲-۴-۳-۲- استرین، پاتوتیپ و نژاد
به دنبال یافته­هایی مبنی بر وجود جمعیت­های V. dahliae با بیماریزایی­های مختلف، دو استرین با بیماریزایی شدید (برگریز، T1 ، T9 یا P1) و بیماریزایی کمتر (غیر برگریز، SS4 یا P2) در جدایه­های عامل بیماری پژمردگی ورتیسیلیومی پنبه پیشنهاد شد. مسئله اصلی در رابطه با تعیین استرین، نژاد یا پاتوتیپ و ارقام در جدایه­های V. dahliae بدست آمده از گیاه پنبه به پیچیدگی ژنتیک گونه­ ها و ارقام پنبه مربوط است. مطالعات نشان می­دهد که اثر محیط بر روی همکنش پاتوتیپ­های V. dahlia پنبه کاملاً موثر است (Joaquim and Row, 1990).
علائم تشخیص این دو پاتوتیپ وجود ریزش برگ­ها در ارقام مختلف پنبه می­باشند. هر دو فرم این بیماری نیز در استان­های گلستان و فارس روی پنبه شیوع داشته و خساراتی را هر ساله وارد می­نماید (عرب سلمانی و همکاران، ۱۳۸۳). در بررسی ۶۳۷ جدایه از ۴۳۳ درخت در ۶۵ باغ از ۵ ناحیه زیتون کاری در منطقه اندولوزیا اسپانیا مشخص گردید که اگرچه جدایه­هایی مربوط به هر دو گروه سازگار رویشی (A و B) و هر دو پاتوتیپ برگریز و غیر برگریز وجود داشت، اما اغلب جدایه­ها مربوط به گروه سازگار رویشی A و پاتوتیپ برگریز بودند (Jiménez-Díaz et al., 2011).
تنوع ژنتیکی بین سه جدایه V. dahliae با بهره گرفتن از مارکر مولکولی چندشکلی DNA تکثیر شده تصادفی (RAPD) بررسی گردید و اختلاف مولکولی بین آن­ها، تفاوتها و شباهت­های مرفولوژیکی را تایید نمود (Alshalchi et al., 2008). در بررسی تنوع ژنتیکی ۹۹ جدایه این قارچ با بهره گرفتن از مارکر مولکولی RAPD، مشخص شدکه تنوع ژنتیکی معنی­داری بین جمعیت ورتیسیلیوم وجود داشته و با بهره گرفتن از تکنیک کلاستر، این ۹۹ جدایه به ۱۵ گروه تقسیم شدند (Zhu et al., 1999). زائو و همکاران (Zhou et al., 1999) نیز در چین ۳۷۹ باند RAPD را در بین جدایه­های قارچ ورتیسیلیوم گزارش نمودند. تکنیک ژنتیک مولکولی برای تشخیص و طبقه بندی استرین­های پاتوژن پژمردگی ورتیسلیومی در استرالیا نیز مورد استفاده قرار گرفت، اما الگوی باندهای RAPD همبستگی قوی بین صفات بیماریزایی و ژنتیک مولکولی را نشان نداد (Ramsay, 1996).
۲-۲-۴-۳-۳-جنبه های مولکولی تشخیص
بررسی ژنتیک مولکولی در عوامل پژمردگی ورتیسیلیومی، اولین بار در سال ۱۹۹۰ در پنجمین همایش بین المللی ورتیسیلیوم گزارش گردید. پس از آن مطالعات متعدد مولکولی در رابطه با گونه­ های مختلف، استرین­ها و پاتوتیپ­های عامل پژمردگی صورت گرفت. از این بررسی­ها می­توان به استفاده از اندونوکلئازهای محدود کننده برای برش کل ژنوم و بررسی قطعات بدست آمده بر روی ژل الکتروفورز بر اساس وزن مولکولی اشاره نمود (Perez-Artes et al., 1997). همچنین تفاوت­های ژنتیکی در جدایه­ها با بهره گرفتن از الگوهای پلی­مورفیسم در رابطه با DNA ریبوزومی و میتوکندریایی در گونه­ های مختلف ورتیسیلیوم مورد مقایسه قرار گرفت (Koike et al., 1995; Perez-Artes et al., 1997).
بررسی­ها نشان داد پاتوتیپ­های V. dahliae بدست آمده از پنبه را می­توان از طریق RAPD تشخیص داد. در این رابطه با بهره گرفتن از سه آغازگر، باندهای مشخصی برای تشخیص گروه ­های برگریز و غیر برگریز ارائه شد (Perez-Artes et al., 1997). بررسی­های هریس و یانگ ۱۹۹۵) (Harris and Yong, نیز ارتباط مشخصی بین برخی از گروه ­های VCG و گروه ­های RFLP در ۴۳ جدایه از V. dahliae از انگلستان را نشان داد. اما میانگین بیماریزایی برای هر گروه RFLP/VCG متفاوت بوده است. همچنین گروه ­های بدست آمده با منشاء میزبانی جدایه مرتبط نبودند.
زارع (۱۳۸۲) روش­های مولکولی جهت ارزیابی معیارهای تاکسونومیکی ورتیسیلیوم­های مرتبط با گیاهان را مورد استفاده قرار داد. سی و یک استرین ورتیسیلیوم به وسیله مقایسه ITS-RELPs به چهار کلاستر تقسیم شدند. کلاستر اول در برگیرنده استرین­های گونه تیپ V. luteo-album (Link: Fries) Subramanian، کلاستر دوم شامل  V. dahliae klebahn, V. albo-atrum Reinke & Berthold، V. nubihni pethybridge و V. tricorpus Isaac؛ کلاستر سوم شامل V. theobromae (Turconi) E. Mason & S. Hughes و کلاستر چهارم شامل V. nigrescens pethybridge بود. در این تحقیق الگوهای RFLP به دست آمده از ژن بتا توبولین(β-tubulin gene) حتی قدرت تفکیک بالاتری داشته و هر هفت گونه مورد آزمایش را از یکدیگر تشخیص دادند. بالاترین قدرت تفکیک از الگوهای RFLP حاصل از DNA میتـوکندریایی (mitochondrial DNA-RFLPs) به دست آمد، به طوری که این روش استرین­های گونه­ های V. theobromae و V. nigrescens را در سطح فراگونه­ای از یکدیگر تفکیک نمود. در نهایت مشخص گردید که برش ژن بتا-توبولین توسط آنزیم برش دهنده HaeIII و مقایسه الگوهای به دست آمده روشی قابل اعتماد برای تفکیک دو گونه مهم اقتصادی و بحث برانگیز V. albo-atrum و V. dahliae می­باشد.
یک روش سریع، کارآمد و دقیق جهت شناسایی و تعیین جمعیت V. dahliae در سیب زمینی براساس تکثیر ژن تریپسین پروتئاز با بهره گرفتن از واکنش زنجیره­ای پلیمراز کمی توسط پاچه و همکاران et al., 2013) (Pasche ابداع گردیده که بسیار بهتر از روش­های سنتی (کشت بافت­های آلوده و یا شیرابه ساقه سیب­زمینی روی محیط­های نیمه انتخابی) و نیز روش­های مدرن قبلی (تعیین جمعیت از طریق تکثیر ژن β-tubulin که با بهره گرفتن از QPCR جهت ارزیابی ارقام مقاوم سیب زمینی (بر اساس میزان آلودگی ساقه­ها به قارچ عامل بیماری) انجام می­گرفته، بود. این روش جدید دارای حساسیتی بالا (۲۵/۰ پیکوگرم DNA) بود. به کمک این روش جدید، پاتوژن عامل بیماری را می­توان با فراوانی به­مراتب بالاتر از روش­های سنتی و حتی مدرن قبلی در بافت­های سیب­زمینی ردیابی و شناسایی نمود.
۲-۲-۴-۳-۴-میزبان­ها
۲-۲-۴-۳-۴-۱- میزبان­های ورتیسیلیوم در جهان
قارچ ورتیسیلیوم دامنه وسیعی شامل ۲۰۰ گونه متعلق به ۴۰ خانواده از گیاهان زراعی، صنعتی، سبزیجات و درختان میوه و سایه­دار را مورد حمله قرار می­دهد (Agrios, 2005).
خانواده­های مختلف گیاهی که توسط عوامل پژمردگی ورتیسیلیومی مورد حمله قرار می­گیرند در جدول ۲-۱ ارائه گردید (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳).
جدول ۲-۱- تعداد گونه­ ها در خانواده­های مختلف گیاهی که توسط عوامل پژمردگی ورتیسیلیومی مورد حمله قرار می­گیرند.