۴-۴-۲-اثر چای سبز بر بیان ژن ‌liver alpha amylase بر روی موش های چاق:
کنترل عادی
چاق عادی
نمودار۴-۸ نشان می دهد که چای سبز بر بیان ژن liver alpha amylase موش های چاق تیمار اثر دارد . بیان ژن liver alpha amylase موش های چاق تیمار در مقایسه با موش های چاق عادی کاهش پیدا کرده است و این کاهش از نظر آماری معنا دار است p value ≤ ۰٫۰۴)). میزان متوسط تغیرات بیان ژن liver alpha amylase ، درموش های چاق تیمار ۵۳/۱± ۰۰/۱ و در موش های چاق عادی ۸۸/۳±۰۲/۴ بود .

چاق تیمار چاق عادی
چاق عادی
چاق تیمار
نمودار۴- ۸- متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی و چاق تیمار

۴-۵-اندازه گیری آلفا آمیلازدر سرم به روش فتومتریک:

نمودار ۴-۹ نشان می دهد که میزان تغییرات آمیلاز در سرم موش های چاق تیمار در مقایسه با موش های چاق عادی و موش های کنترل تیمار در مقایسه با موش های کنترل عادی کاهش پیدا کرده است ولی این تفاوت از لحاظ آماری معنادار نیست.
IU/ml
نمودار۴- ۹-تغییرات آمیلاز در سرم موش های چاق و نرمال به روش فتومتریک
فصل پنجم
بحث و نتیجه ­گیری

۵-۱- بحث و نتیجه گیری:

اختلالات جذب کربوهیدرات ممکن است ایجاد مشکلاتی در سلامت افراد نماید از جمله عوارض آن ،دیابت،چاقی و بیماری های دهان و دندان است که باعث تهدید سلامت جمعیت در سراسر جهان می شود (۱۲ و۳).
چاقی یک خطر تهدید کننده سلامتی ، همراه با افزایش خطر ابتلا به بیماری های قلبی و عروقی (به طور عمده بیماری قلبی و سکته مغزی)، دیابت نوع ۲، اختلالات اسکلتی عضلانی (به خصوص آرتروز) و انواع خاصی از سرطان (آندومتر، PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است) و روده بزرگ) است. سازمان بهداشت جهانی (WHO[30]) تخمین زده است که در سال ۲۰۰۵، حدود ۶/۱ میلیارد بزرگسال در سراسر جهان اضافه وزن و حداقل ۴۰۰ میلیون نفر چاق بودند. علاوه بر این، سازمان بهداشت جهانی تخمین زده است که حداقل ۲۰ میلیون کودک زیر سن ۵ سال اضافه وزن داشتند. تعداد پیش بینی شده برای سال ۲۰۱۵، بسیار بیشتر هستند، انتظار می رود ۳/۲ میلیارد بزرگسال مبتلا به اضافه وزن و ۷۰۰ میلیون نفر مبتلا به چاقی باشند(۷۴).
علت افزایش بیش از حد وزن بدن ، عدم تعادل بین دریافت انرژی و مصرف آن است. سازمان بهداشت جهانی در نظر دارد یک تغییر جهانی در رژیم غذایی ایجاد کند. بدین صورت که از سوی مصرف غذاهای با دانسیته انرژی بالا که دارای چربی و قند بالا هستند به سمت غذاهایی که سرشار از ویتامین ها، مواد معدنی و دیگر عناصر کم مصرف می باشند تغییر سبک ایجاد کند. در حال حاضر، یک روند به سمت کاهش فعالیت بدنی وجود دارد.علت این امر می تواند کم تحرکی در انواع بسیاری از کار ها، تغییر شیوه های حمل و نقل و افزایش شهرنشینی باشد(۵۵).
کنترل رژیم غذایی و ورزش، از عوامل موثر در کاهش وزن هستند. تعدادی از روش های تغذیه ای و رژیم های غذایی با نسبت متفاوتی از لیپیدها، پروتئین ها و کربوهیدرات ها برای کاهش وزن تجویز می شوند. مرحله اولیه در کاهش وزن، محدود کردن مصرف غذاهای دارای چربی های اشباع شده بود. با این حال رژیم های غذایی دارای مقدار کمی از چربی های اشباع در کاهش وزن لزوما نتیجه مورد انتظار را ایجاد نمی کند. به تازگی نسبت به کاهش مصرف کربوهیدرات ها، به ویژه کربوهیدراتهای تصفیه شده، به عنوان یک روش برای کاهش وزن و کاهش بروز خطر ابتلا به بیماری های مربوط به چاقی توجه زیادی می شود.
در بسیاری از رژیم های غذایی، کربوهیدرات ها بزرگترین منبع کالری است. کربوهیدرات ها قبل از اینکه توسط بدن جذب می شود باید به مونوساکاریدها شکسته شده باشند. این شکست توسط دو آنزیم آمیلاز و گلوکوزیداز رخ می دهد (۵۱).
نرخ ابتلا به دیابت به طرز قابل توجهی در ۵۰ سال اخیر به موازات چاقی افزایش یافته است. بیماری دیابت به سبب شیوع فراوانی که دارد امروز، به عنوان یک مشکل بزرگ بهداشتی در دنیا مطرح است().شیوع دیابت در کشور ما در سال های ۱۹۹۵ و ۲۰۰۰میلادی به ترتیب ۵%/۵ و%۷/۵ برآورد شده است که احتمال می رود در سال ۲۰۲۵به %۸/ ۶برسد().در سال ۲۰۰۰ میلادی شیوع جهانی دیابت ۸/۲%گزارش شده و برآورد شده که در سال۲۰۲۵ این میزان به ۴/۴% برسد.به این معنی که در سال ۲۰۲۵، ۳۶۶ ملیون نفر از جمعیت دنیا به دیابت مبتلا خواهند بود().در این بیماری هیپرگلیسمی در اثر ترشح ناکافی انسولین ، اختلال در عملکرد انسولین و یا هردو ایجاد می شود و با عوارض چون پر فشاری خون،انواع نارسایی های قلبی،رتینوپاتی،نوروپاتی و نفروپاتی همراه است. لذا یکی از رویکردهای درمان و کنترل دیابت کاهش هیپر گلیسمی بعد از غذا می باشد.این حالت با تاخیر در هضم و جذب گلوکز از طریق مهارکننده های هضم کربوهیدرات ها مثل مهارکننده های آنزیم های آلفا-گلوکوزیداز و آلفا-آمیلاز میسر است(۷۷).
هضم کربوهیدرات ها در دهان آغاز می شود، این امر توسط آمیلاز ترشح شده توسط غدد بزاق انجام می پذیرد. این روند در معده به علت محیط اسیدی بالا و از بین بردن فعالیت آمیلاز متوقف می شود. هنگامی که مواد غذایی وارد روده می شود، pH اسیدی توسط انتشار بی کربنات از لوزالمعده و مخاط دیواره روده خنثی می شود. آمیلاز در روده کوچک توسط لوزالمعده ترشح می شود. آنزیم آلفا گلوکوزیداز از مرز بین پرزهای روده کوچک ترشح می شود. آمیلاز شکسته شدن کربوهیدرات به الیگوساکاریدها را انجام می دهد و آنزیم های گلوکوزیداز (از جمله لاکتاز، مالتاز و ساکارز) تجزیه کامل الیگوساکاریدها به واحدهای مونوساکارید را انجام می دهد. تنها واحد مونوساکارید هستند که به بدن جذب می شوند. قند و سایر مونوساکاریدها از طریق ورید باب کبد به کبد منتقل می شود. مونوساکاریدها بلافاصله برای تولید انرژی مورد استفاده قرار نمی گیرند یا به صورت گلیکوژن در کبد و یا به عنوان چربی (تری گلیسیرید) در بافت چربی، کبد و پلاسما ذخیره می شوند. به نظر می رسد در این قسمت از متابولیسم گلیکوژن آلفا آمیلاز کبدی نقش عمده ای را ایفا می کند(۹).
مطالعه بر روی بیان آنزیم آلفا آمیلاز توسط کبد و مقدار آنزیم در سرم از سال ۱۹۶۰ آغاز شد که روند این مطالعات را در سال های مختلف مورد بررسی قرار می دهیم . در سال ۱۹۶۰مشاهده شد که آنزیم بیان شده توسط کبد خاصیت آنتی ژنی مشابه نوع بزاقی را دارد . علاوه بر این مقالات بسیاری عنوان کرده اند که میزان آمیلاز موجود در سرم در شرایط نرمال از جهت فیزیولوژیک بیشتر از منبع کبد تامین می شود تا منابع دیگری چون بزاق و یا پانکراس(۴۰).
از آنجا که تنها مقدار بسیار کمی از پروتئین آمیلاز در عصاره کبدی تشخیص داده شده است ، مشخص نیست آیا آمیلازاختصاصی کبدی وجود دارد و یا این رونوشت از غدد بزاقی مشتق شده و از طریق
گردش خون به کبد رسیده است(۴۰).
McGeachin &Potter در سال ۱۹۶۰گزارش کردند که بروز آسیب در کبد به واسطه مواد شیمیایی باعث کاهش محسوس فعالیت آنزیم آمیلاز در کبد و سرم می شود.همچنین گزارش شده است که آمیلاز کبدی موش های سالم از نظر تغذیه ای مخلوطی از آمیلاز سرم و گلیکوژن می باشد(۴۰).
هرچند که بیان آمیلاز به وسیله کبد به اثبات رسیده و سکانس نوکلئوتیدی این آنزیم در موش تعیین شده است اما هنوز عملکرد قطعی و مشخصی برای این آنزیم شناخته نشده است اما بسیاری از مقالات عنوان کرده اند که این آنزیم در متابولیسم گلیکوژن در کبد نقش عمده ای را ایفا می کند(۴۰).
نقش هورمون ها در میزان فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز کبدی مشخص شده است به صورتیکه تزریق آدرنالین باعث افزایش چشمگیر فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز در سرم می شود در حالیکه گلوکاگون باعث کاهش فعالیت آنزیم می شود.در صورتیکه کبد دچار آسیب سلولی شده باشد گلوکاگون باعث کاهش فعالیت آنزیم نمی شود که همین امر خود موید نقش آنزیم آلفا آمیلاز کبدی در مسیر های متابولیسمی است(۴۰).
.مشخص شده است آنزیم آمیلاز گلیکوزیله بزاقی ظرفیت بیشتری در هیدولیز مالتو تریوز(G3) دارد که این امر نقش فیزولوژیک زنجیره قندی این آنزیم را در تبدیل (G3) به گلوکز نشان می دهد . اگر آنزیم آمیلاز درکبد دارای زنجیره قندی بشود و از (G3) ، گلوکوز ایجاد نماید .می توان ادعا کرد که آنزیم آلفا آمیلاز کبدی همانند سایر آنزیم های گلیکوژن فسفریلاز در متابولیسم گلیکوژن در کبد نقش ایفا کند (۴۰).
درسال ۱۹۷۳ tsujino وهمکارانش گزارش کردند آنزیمی در کبد مسئول متابولیسم گلیکوژن و تولید گلوکوز است(۶۸).
درسال ۲۰۰۱ koyama و همکارانش بر روی میزان بیان ژن آلفا آمیلاز در کبد رت کار کردند و در مقاله آنها عنوان شد این آنزیم با وزن ۵۰kDa گلیکوزیله می باشد که دارای تمایل بالایی به گلیکوژن است.
با توجه به نتایج به دست آمده از این پژوهش ،مشاهده شد که متوسط میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش هایی که تحت رژیم غذایی با کالری بالا قرار گرفتند بیش از دو برابر موش هایی با رژیم غذایی معمول است. این امر نشانگر گرایش بیشتر آلفا آمیلاز کبدی در متابولیسم گلیکوژن است(۳۴).
با توجه به افزایش سطح سرمی آمیلاز در موش هایی که تحت رژیم غذایی با کالری بالا قرار گرفتند نسبت به گروه کنترل نیز می توان نتیجه گرفت که ایزو آنزیم کبدی با چاقی و افزایش میزان گلیکوژن ارتباط مستقیمی دارد . مهار کننده های آلفا آمیلاز مانع جذب کربو هیدرات ها شده و در نتیجه باعث لاغری و جلوگیری از اثرات بیماریهایی مانند دیابت تیپ ۲ می شوند . از مهارکننده های آلفا آمیلاز می توان به چای سبز اشاره کرد. پلی فنول های چای سبز می توانند سبب مهار آلفا آمیلاز شوند. اصلی ترین گروه تشکیل دهنده پلی فنول ها در چای سبز کتچین ها می باشند که به مقدار قابل ملاحظه ای در چای سبز یافت می شوند و دلیل اصلی طمع تلخ چای هستند.کتچین های موجود در چای سبز خود به چهار گروه به نام های اپی کتچین ،اپی گلو کتچین،اپی کتچین گالات و اپی گالو کتچین گالات تقسیم می شوند.بیش از ۵۰% از کتچین کل چای سبز را اپی گالو کتچین گالات تشکیل می دهد که خاصیت آنتی اکسیدانی آن نسبت به دیگر انواع کتچین بیشتر است . بنابراین اپی گالو کتچین گالات موثرترین کتچین موجودر در چای سبز در مهار آلفاآمیلاز است (۷و۴۶).
ماده ی موجود در چای سبز به کاهش پیک(قله) افزایش قندخون هنگام مصرف غذاهای نشاسته ای در موش کمک می کند، این استراتژی غذایی راه جدیدی برای افراد مبتلا به دیابت برای کمک به کنترل قندخون این افراد می باشد.
قند خون موشهایی که با چای سبز که حاوی epigallocatechin-3- gallateیا EGCGمی باشد به عنوان ماده ی آنتی اکسیدان تغذیه شده اند در هنگام مصرف نشاسته ی ذرت در مقایسه با موشهایی که با این ماده تغذیه نشده اند، کمتر افزایش می یابد. (پیک یا قله ی افزایش قند در موشهایی که باEGCGتغذیه شده اند پایین تر است). پیک یا قله ی افزایش قندخون نسبت به موشهایی که با EGCG تغذیه نشده اند ۵۰ درصد پایین تر است.
دوز ماده ی EGCGکه موش با آن تغذیه میشود حدود یک ونیم فنجان چای سبز در روز برای انسان است.
دکتر Lambertو شاگردانش معتقدند EGCGهنگامیکه با یک ماده ی حاوی نشاسته به موش خورانده میشود، موثرتر است . برای انسان مصرف چای سبز می تواند افزایش قندخون هنگام مصرف مواد نشاسته ای مانند نان که معمولاٌ بخشی از صبحانه است را کنترل کند.
دکتر Lambertمی گوید: اگر آنچه شما همراه با چای سبزمیل می کنید حاوی نشاسته باشد می توانید اثرات سودمند آنرا مشاهده کنید برای مثال خوردن چای سبز همراه با نان در هنگام صبحانه.
EGCGهیچ اثرقابل توجهی بروی قله ی افزایش قندخون موشهایی که با گلوکز یا مالتوزتغذیه می شدند، نشان نمی دهد.دکتر Lambertمی گوید: دلیل تأثیر EGCG بروی کاهش پیک یا قله ی افزایش قندخون در خوردن مواد نشاسته ای نحوه ی تبدیل نشاسته به قندهای ساده دربدن است.
آنزیمی بنام آلفا آمیلاز که در دهان و پانکراس تولید میشود نشاسته را به مالتوز و گلوکز می شکند.EGCG با ممانعت از این آنزیم سبب می شود نشاسته به مالتوزوگلوکز تبدیل نشود. دانشمندان نشان دادند که EGCG سبب کاهش فعالیت آلفا آمیلاز پانکراس تا ۳۴ درصد می شود.
چنانچه این مکانیزیم در انسان نیز وجود داشته باشد افراد می توانند با حذف شکر از فنجان چای سبز خود پیک افزایش قند خون را درهنگام مصرف مواد نشاسته ای کاهش دهند. اگر شکر به چای سبز افزوده شود تأثیر محدودکننده ی آن درکاهش فعالیت آمیلاز حذف می شود زیرا شکر به قندهای ساده تبدیل شده و قندخون را بالا می برد.
بنابراین باید چای سبز و نشاسته همزمان مصرف شود برای مثال اگر قبل از خوردن یک تکه نان تست، یک فنجان چای سبز خورده شود تغییراتی در مقدار پیک قندخون زیاد نخواهد بود(۷۵).
در پژوهشی که ما انجام دادیم مشخص شد که از نظر مهار آنزیم در سطح سرم عصاره آبی الکلی چای سبز باعث مهار آلفا آمیلاز در سطح سرم شد. هر چند این نتایچ از لحاظ آماری معنا دار نیست .
در سطح بیان ژن ، عصاره آبی الکلی چای سبز باعث کاهش بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق شد. اما تغییری که در بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های نرمال ایجاد کرد از لحاظ آماری معنادار نیست. مطالعات مشابهی بر روی تاثیر چای سبز بر روی بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی انجام نشده است.
در کل می توان نتیجه گرفت بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در چاقی افزایش یافته و استفاده از مهار کننده های آنزیمی می تواند به عنوان روشی برای درمان و کنترل چاقی و قند خون به کار روند.
۵-۲- پیشنهادات:

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت 40y.ir مراجعه نمایید.

از آنجا که از مهمترین عوامل مؤثر بر نتایج یک آزمایش تعداد نمونه ها یا جامعه ی آماری مورد پژوهش است که می تواند به طور کاملاً تأثیر گذاری نتایج حاصل از پژوهش را دستخوش تغییر کند، پیشنهاد می شود. مطالعات آتی بر روی پروژه های مشابه با تعداد نمونه ی بیشتری انجام شود. اهمیت این موضوع با در نظر گرفتن سطح معنا داری مطرح می شود.

بررسی بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در حالت های مختلف فیزیولوژیک (مانند چاقی ،دیابت ،گرسنگی و ….) انجام شود.

بررسی بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی بر روی موش پس از تجویز مهار کننده های مختلف آلفا آمیلاز در موش (خوراکی ،تزریقی ) انجام شود.

بررسی بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی بر روی سایر جانداران مشابه با فیزیولوژی انسان در حالت های مختلف فیزیولوژیک (مانند چاقی ،دیابت ،گرسنگی و….) انجام شود.

به منظور برداشت دقیق تری از میزان تغییرات بیان ژن های مورد مطالعه، از تکنیک هایی با دقت بیشتر از جمله Real-time PCR Taq-man Probe استفاده شود.

به منظور تصدیق و اطمینان بیشتر از یافته های این مجموعه مانند مهار بیان ژن آنزیم آلفا آمیلاز کبدی توسط عصاره آبی الکلی چای سبز ، طیف مختلفی از مهار کننده های شناخته شده آلفا آمیلاز با دوزهاو زمان های تاثیر مختلف بر روی رده هپاتوسیت موش و یا سایر جانداران مشابه با فیزیولوژی انسان تاثیر داده شود و نتایج هم در سطح بیان ژن وهم در سطح بیان پروتئین مورد مطالعه قرار بگیرد.

روش اختصاصی و دقیقی برای سنجش این نوع ایزو آنزیم آمیلاز وجود ندارد. راه اندازی روش دقیقی برای سنجش میزان آلفا آمیلاز کبدی یکی دیگر از پیشنهادات این پایان نامه است.

منابع

Abe,A., Yoshida,H., Tonozuka,T., Sakano,Y., Kamitori,S.,2005, Complexes of Thermoactinomyces vulgaris R-47 alpha-amylase 1 and pullulan model oligossacharides provide new insight into the mechanism for recognizing substrates with alpha-(1,6) glycosidic linkages,FEBS J,Vol.272,No.23,p.6145–۶۱۵۳٫

Aghajari, N., [etal].,1998, Crystal structures of the psychrophilic alpha-amylase from Alteromonas haloplanctis in its native form and complexed with an inhibitor, Protein Sci,Vol.7,No.3,p. 564–۵۷۲ .

Aguiar,L.G.K.,Villela,N.R.,Bouskela,E.A.,2007, Microcirculação no Diabetes: Implicações nas Complicações Crônicas e Tratamento da Doença,Arq Bras Endocrinol Metab ,Vol. 51,p.204-211.

Ammann ,R.W., Berk, J.E., Fridhandler, L., Ueda, M., Wegmann,W.,1973, Hyperamylasemia with carcinoma of the lung,Ann Intern Med ,Vol.78,p.521–۵۲۶٫

Bernfeld,P.,1955,Methods in Enzymology, Cell-wide Metabolic Alterations Associated with Malignancy, Vol.1,p.149-158.

Booth,T., [etal].,1948, Theory of Electrokinetic Effects,Nature,Vol.161,No. 4081,p.83-86.

Bose,M., [etal].,2008,The major green tea polyphenol, (−)-epigallocatechin-3-gallate, inhibits obesity, metabolic syndrome, and fatty liver disease in high fat-fed mice,J Nutr,Vol. 138,p.1677–۱۶۸۳٫

Brayer,G.D.,Luo, Y., Withers,S.G.,1995, The structure of human pancreatic a-amylase at 1.8 A resolution and comparisons with related enzymes,Protein Sci,Vol.4,p.1730-1742.

Burtis,C.A., ash wood,E.R., 1999,enzymes amylase, 3rd ed .Philadelphia: W.B Saunders company,p.616-19.