در روز نهم بعد از تولد، موش ها با دی اتیل اتر بیهوش میشدند. سپس حیوان در تشتک جراحی قرار میگرفت و دست و پای حیوان ثابت میشد. بعد ناحیه قفسه سینه باز شده و به وسیله ست سرم و از طریق آئورت با محلول سالین 9/0 درصد و متعاقباً با محلول سرد پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار پرفیوژ میشد. پس از اتمام پرفیوژن جمجمه به مدت 1 شب در پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار نگهداری شد. روز بعد مغز از جمجمه خارج میشد.
شکل 3-5- پرفیوژن
3-7-2- برش گیری
پس از بیرون آوردن مغز از جمجمه، مغز به مدت 24 ساعت در محلول پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار قرار داده میشد تا کاملاً بافت آن فیکس شود. سپس بلوکی شامل ساقه مغز برای تهیه برشهایی کرونال به ضخامت 80 میکرومتر در دستگاه ویبرواسلایس قرار داده شد. تیغههای استفاده شده در این دستگاه از جنس استیل ضد زنگ بود. سرعت حرکت تیغه و فرکانس لرزش آن قابل تنظیم است. از هر 4-3 برش تهیه شده یکی برای واکنش ایمونوهیستوشیمی انتخاب شده و 3 بار با محلول بافر فسفات 1/0 مولار شتستشو میشدند.
3-7-3- ایمونوهیستوشیمی
برای حذف فعالیت پرکسیدازی اندوژن، برشهای شسته شده به مدت 35 دقیقه در محلول هیدروژن پراکسید 3 درصد در بافر فسفات 1/0 مولار قرار گرفتند و پس از 2 بار شستشو با بافر فسفات (پنج دقیقه) 1/0 مولار به مدت یک ساعت در محلول blocking که شامل بافر فسفات 1/0 مولار، Triton X-100 3/0 درصد و سرم آلبومین گاوی[37] 1/0 درصد بود، منتقل شدند. سپس برشها به مدت 72 ساعت در محلول حاوی آنتیبادی کاسپاز 3 در بافر فسفات 1/0 مولار حاوی سرم آلبومین گاوی 1/0 درصد و Triton X-100 3/0 درصد قرار میگرفتند. پس از 2 بار شستشو با بافر فسفات (دو دقیقه) برشها به مدت 12 ساعت در محلول حاوی آنتیبادی ثانویه در بافر فسفات 1/0 مولار حاوی سرم آلبومین گاوی 1/0 درصد و Triton X-100 3/0 درصد قرار داده شدند. برشها بعد از خروج از محلول حاوی آنتی بادی ثانویه یکبار با بافر فسفات 1/0 مولار به مدت دو دقیقه شستشو داده میشدند. در آخرین مرحله محصول واکنش در حضور دی آمینوبنزیدین[38] با غلظت 1 میلیگرم بر میلیلیتر و هیدروژن پراکسید 02/0 درصد در بافر Tris-Hcl 05/0 مولار با 2/7PH= قابل مشاهده گردید و برشها پس از 2 بار شستشو با بافر فسفات 1/0 مولار (دو دقیقه) به لام ژلاتینی منتقل شدند. بعد از انتقال برشها روی لام ژلاتینی شده، آنها را در رک چیده و پس از خشک شدن به مدت 10 ثانیه در جار حاوی الکل 70 درصد در اسید استیک، 10 ثانیه در الکل 97 درصد، 10 ثانیه در الکل مطلق، 5 دقیقه در زایلول 1 و 5 دقیقه در زایلول 2 قرار داده شدند. سپس روی لام چند قطره چسب انتلان ریخته و لامل به آهستگی روی لام قرار داده شد.
3-7-4- مطالعه میکروسکوپی
در این مرحله به کمک میکروسکوپ، نورونهای نشاندار شده در پلانهای مختص آنها از اطلس پاکسینوس- واتسون مورد مطالعه قرار گرفت. در پایان به منظور نشان دادن تغییرات ایجاد شده در تعداد نورونها در گروه های مختلف از هسته سجافی پشتی عکس میکروسکوپی تهیه شد.
3-8- آنالیز آماری
به منظور تعیین برابری واریانسها بین سه گروه از تست Leven استفاده شد. از تست Shapiro wilk به منظور ارزیابی نرمال بودن داده ها استفاده شد. در صورت برابر بودن واریانسها و نرمال بودن داده ها از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه ANOVA و تست Tukey و یا T-test جفت نشده استفاده شد. در صورت برابر نبودن واریانسها و نرمال بودن داده ها از تستTamhane برای مقایسه میانگینها استفاده شد. در صورت نرمال نبودن داده ها از تست غیر پارامتریک Mann-whitney برای مقایسه میانگینها استفاده شد. اختلافهای با 05 /0 > P معنیدار در نظر گرفته شدند.
فصل چهارم
نتایج
4- نتایج
4-1 مقایسه فعالیت حرکتی
به منظور بررسی فعالیت حرکتی موشها، تست Open field انجام گرفت. آنالیز داده های بدست آمده نشان میدهد تعداد دفعات عبور موشهای نر گروه دریافت کننده ساخارین از خطوط نسبت به گروه کنترل، افزایش معنیداری را از نظر آماری نشان داد (P<0.01). (نمودار 4-1).
ethosuximide
نمودار 4-1- مقایسه میانگین تعداد دفعات عبور از خطوط موشهای نر در گروه های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید در آزمون .Open field
**P<0.01در مقایسه با گروه کنترل
تعداد دفعات عبور از خطوط موشهای ماده در گروه های دریافت کننده ساخارین نسبت به گروه کنترل، افزایش معنیداری را از نظر آماری نشان داد (P<0.001). تعداد دفعات عبور از خطوط موشهای ماده گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نیز نسبت به گروه کنترل، افزایش معنیداری را از نظر آماری نشان داد (P<0.01) (نمودار 4-2).
ethosuximide
نمودار 4-2- مقایسه میانگین تعداد دفعات عبور از خطوط موشهای ماده در گروه های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید در آزمون .OPEN FIELD
***P<0.001در مقایسه با گروه کنترل
**P<0.01 در مقایسه با گروه کنترل
4-2- تأثیر دریافت ساخارین و اتوسوکسیماید بر میزان اضطراب در آزمون ماز بعلاوه مرتفع
آنالیز داده های بدست آمده نشان داد مدت زمان حضوردر بازوی باز در موشهای نر سه گروه تفاوت معنیداری را از نظر آماری نشان نداد (نمودار 4-3).
ethosuximide
نمودار 4-3- مقایسه میانگین مدت زمان حضور در بازوی باز در موشهای نر گروه های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید در ماز بعلاوه مرتفع.
بین سه گروه تفاوت معنیداری مشاهده نشد.
مدت زمان حضوردر بازوی باز در موشهای ماده گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری را از نظر آماری نشان داد (P<0.05). مدت زمان حضوردر بازوی باز در موش های ماده گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه ساخارین کاهش معنیداری را از نظر آماری نشان داد (P<0.01) (نمودار 4-4).
ethosuximide
نمودار 4-4- مقایسه میانگین مدت زمان حضور در بازوی باز در موشهای ماده گروه های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید در ماز بعلاوه مرتفع.
P<0.05* در مقایسه با گروه کنترل
P<0.01## در مقایسه با گروه ساخارین
4-3- تأثیر دریافت ساخارین و اتوسوکسیماید در آزمون شنای اجباری
مدت زمان بیحرکت ماندن در روز اول آزمون شنای اجباری در نرهای گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه کنترل از نظر آماری کاهش معنیداری نشان داد (P<0.01). مدت زمان بیحرکت ماندن در روز اول آزمون شنای اجباری در نرهای گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه دریافت کننده ساخارین از نظر آماری کاهش معنیداری نشان داد (P<0.05) (نمودار 4-5).
ethosuximide
نمودار 4-5- مقایسه میانگین مدت زمان عدم تحرک در آزمون شنای اجباری در روز اول بین موشهای نر گروه های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید.
**P<0.01 در مقایسه با گروه کنترل
P<0.05# در مقایسه با گروه ساخارین
مدت زمان بیحرکت ماندن در روز اول آزمون شنای اجباری در مادههای سه گروه از نظر آماری تفاوت معنیداری نشان نداد (نمودار 4-6).
ethosuximide
نمودار 4-6- مقایسه میانگین مدت زمان عدم تحرک در آزمون شنای اجباری در روز اول بین
موشهای ماده گروه های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید.
بین سه گروه تفاوت معنیداری مشاهده نشد.
مدت زمان بیحرکت ماندن در روز دوم آزمون شنای اجباری در نرهای سه گروه از نظر آماری تفاوت معنیداری نشان نداد (نمودار 4-7).
ethosuximide
نمودار 4-7- مقایسه میانگین مدت زمان عدم تحرک در آزمون شنای اجباری در روز دوم بین موشهای نر گروه کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید.
بین سه گروه تفاوت معنیداری مشاهده نشد.
مدت زمان بیحرکت ماندن در روز دوم آزمون شنای اجباری در مادههای گروه دریافت کننده ساخارین نسبت به گروه کنترل از نظر آماری کاهش معنیداری نشان داد (P<0.05). مدت زمان بیحرکت ماندن در روز دوم آزمون شنای اجباری در مادههای گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه دریافت کننده ساخارین از نظر آماری افزایش معنیداری نشان داد (P<0.05). (نمودار 4-8).