در روز نهم بعد از تولد، موش ها با دی اتیل اتر بیهوش می­شدند. سپس حیوان در تشتک جراحی قرار می­گرفت و دست و پای حیوان ثابت می­شد. بعد ناحیه قفسه سینه باز شده و به وسیله ست سرم و از طریق آئورت با محلول سالین 9/0 درصد و متعاقباً با محلول سرد پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار پرفیوژ می­شد. پس از اتمام پرفیوژن جمجمه به مدت 1 شب در پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار نگهداری شد. روز بعد مغز از جمجمه خارج می­شد.

شکل 3-5- پرفیوژن

 

3-7-2- برش گیری

پس از بیرون آوردن مغز از جمجمه، مغز به مدت 24 ساعت در محلول پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار قرار داده می­شد تا کاملاً بافت آن فیکس شود. سپس بلوکی شامل ساقه مغز برای تهیه برش­هایی کرونال به ضخامت 80 میکرومتر در دستگاه ویبرواسلایس قرار داده شد. تیغه­های استفاده شده در این دستگاه از جنس استیل ضد زنگ بود. سرعت حرکت تیغه و فرکانس لرزش آن قابل تنظیم است. از هر 4-3 برش تهیه شده یکی برای واکنش ایمونوهیستوشیمی انتخاب شده و 3 بار با محلول بافر فسفات 1/0 مولار شتستشو می­شدند.

3-7-3- ایمونوهیستوشیمی

برای حذف فعالیت پرکسیدازی اندوژن، برش­های شسته شده به مدت 35 دقیقه در محلول هیدروژن پراکسید 3 درصد در بافر فسفات 1/0 مولار قرار گرفتند و پس از 2 بار شستشو با بافر فسفات (پنج دقیقه) 1/0 مولار به مدت یک ساعت در محلول blocking که شامل بافر فسفات 1/0 مولار، Triton X-100 3/0 درصد و سرم آلبومین گاوی^[37] 1/0 درصد بود، منتقل شدند. سپس برشها به مدت 72 ساعت در محلول حاوی آنتی­بادی کاسپاز 3 در بافر فسفات 1/0 مولار حاوی سرم آلبومین گاوی 1/0 درصد و Triton X-100 3/0 درصد قرار می­گرفتند. پس از 2 بار شستشو با بافر فسفات (دو دقیقه) برش­ها به مدت 12 ساعت در محلول حاوی آنتی­بادی ثانویه در بافر فسفات 1/0 مولار حاوی سرم آلبومین گاوی 1/0 درصد و Triton X-100 3/0 درصد قرار داده شدند. برش­ها بعد از خروج از محلول حاوی آنتی بادی ثانویه یکبار با بافر فسفات 1/0 مولار به مدت دو دقیقه شستشو داده می­شدند. در آخرین مرحله محصول واکنش در حضور دی آمینوبنزیدین^[38] با غلظت 1 میلی­گرم بر میلی­لیتر و هیدروژن پراکسید 02/0 درصد در بافر Tris-Hcl 05/0 مولار با 2/7PH= قابل مشاهده گردید و برش­ها پس از 2 بار شستشو با بافر فسفات 1/0 مولار (دو دقیقه) به لام ژلاتینی منتقل شدند. بعد از انتقال برش­ها روی لام ژلاتینی شده، آن­ها را در رک چیده و پس از خشک شدن به مدت 10 ثانیه در جار حاوی الکل 70 درصد در اسید استیک، 10 ثانیه در الکل 97 درصد، 10 ثانیه در الکل مطلق، 5 دقیقه در زایلول 1 و 5 دقیقه در زایلول 2 قرار داده شدند. سپس روی لام چند قطره چسب انتلان ریخته و لامل به آهستگی روی لام قرار داده شد.

3-7-4- مطالعه میکروسکوپی

در این مرحله به کمک میکروسکوپ، نورون­های نشاندار شده در پلان­های مختص آن­ها از اطلس پاکسینوس- واتسون مورد مطالعه قرار گرفت. در پایان به منظور نشان دادن تغییرات ایجاد شده در تعداد نورون­ها در گروه ­های مختلف از هسته سجافی پشتی عکس میکروسکوپی تهیه شد.

3-8- آنالیز آماری

به منظور تعیین برابری واریانس­ها بین سه گروه از تست Leven استفاده شد. از تست Shapiro wilk به منظور ارزیابی نرمال بودن داده ­ها استفاده شد. در صورت برابر بودن واریانس­ها و نرمال بودن داده ­ها از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه ANOVA و تست Tukey و یا T-test جفت نشده استفاده شد. در صورت برابر نبودن واریانس­ها و نرمال بودن داده ­ها از تستTamhane برای مقایسه میانگین­ها استفاده شد. در صورت نرمال نبودن داده ­ها از تست غیر پارامتریک Mann-whitney برای مقایسه میانگین­ها استفاده شد. اختلاف­های با 05 /0 > P معنی­دار در نظر گرفته شدند.

فصل چهارم

 

نتایج

 

4- نتایج

 

4-1 مقایسه فعالیت حرکتی

به منظور بررسی فعالیت حرکتی موش­ها، تست Open field انجام گرفت. آنالیز داده ­های بدست آمده نشان می­دهد تعداد دفعات عبور موش­های نر گروه دریافت کننده ساخارین از خطوط نسبت به گروه کنترل، افزایش معنی­داری را از نظر آماری نشان داد (P<0.01). (نمودار 4-1).
ethosuximide
نمودار 4-1- مقایسه میانگین تعداد دفعات عبور از خطوط موش­های نر در گروه ­های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید در آزمون .Open field
^**P<0.01در مقایسه با گروه کنترل
تعداد دفعات عبور از خطوط موش­های ماده در گروه ­های دریافت کننده ساخارین نسبت به گروه کنترل، افزایش معنی­داری را از نظر آماری نشان داد (P<0.001). تعداد دفعات عبور از خطوط موش­های ماده گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نیز نسبت به گروه کنترل، افزایش معنی­داری را از نظر آماری نشان داد (P<0.01) (نمودار 4-2).
ethosuximide

نمودار 4-2- مقایسه میانگین تعداد دفعات عبور از خطوط موش­های ماده در گروه ­های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید در آزمون .OPEN FIELD

 

^***P<0.001در مقایسه با گروه کنترل

 

^**P<0.01 در مقایسه با گروه کنترل

 

4-2- تأثیر دریافت ساخارین و اتوسوکسیماید بر میزان اضطراب در آزمون ماز بعلاوه مرتفع

آنالیز داده ­های بدست آمده نشان داد مدت زمان حضوردر بازوی باز در موش­های نر سه گروه تفاوت معنی­داری را از نظر آماری نشان نداد (نمودار 4-3).
ethosuximide

نمودار 4-3- مقایسه میانگین مدت زمان حضور در بازوی باز در موش­های نر گروه ­های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید در ماز بعلاوه مرتفع.

 

بین سه گروه تفاوت معنی­داری مشاهده نشد.

مدت زمان حضوردر بازوی باز در موش­های ماده گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه کنترل کاهش معنی­داری را از نظر آماری نشان داد (P<0.05). مدت زمان حضوردر بازوی باز در موش های ماده گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه ساخارین کاهش معنی­داری را از نظر آماری نشان داد (P<0.01) (نمودار 4-4).
ethosuximide

نمودار 4-4- مقایسه میانگین مدت زمان حضور در بازوی باز در موش­های ماده گروه ­های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید در ماز بعلاوه مرتفع.

 

P<0.05^* در مقایسه با گروه کنترل

 

P<0.01^## در مقایسه با گروه ساخارین

 

4-3- تأثیر دریافت ساخارین و اتوسوکسیماید در آزمون شنای اجباری

مدت زمان بی­حرکت ماندن در روز اول آزمون شنای اجباری در نرهای گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه کنترل از نظر آماری کاهش معنی­داری نشان داد (P<0.01). مدت زمان بی­حرکت ماندن در روز اول آزمون شنای اجباری در نرهای گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه دریافت کننده ساخارین از نظر آماری کاهش معنی­داری نشان داد (P<0.05) (نمودار 4-5).
ethosuximide

نمودار 4-5- مقایسه میانگین مدت زمان عدم تحرک در آزمون شنای اجباری در روز اول بین موش­های نر گروه ­های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید.

 

^**P<0.01 در مقایسه با گروه کنترل

 

P<0.05^# در مقایسه با گروه ساخارین

مدت زمان بی­حرکت ماندن در روز اول آزمون شنای اجباری در ماده­های سه گروه از نظر آماری تفاوت معنی­داری نشان نداد (نمودار 4-6).
ethosuximide

نمودار 4-6- مقایسه میانگین مدت زمان عدم تحرک در آزمون شنای اجباری در روز اول بین
موش­های ماده گروه های کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید.

 

بین سه گروه تفاوت معنی­داری مشاهده نشد.

مدت زمان بی­حرکت ماندن در روز دوم آزمون شنای اجباری در نرهای سه گروه از نظر آماری تفاوت معنی­داری نشان نداد (نمودار 4-7).
ethosuximide

نمودار 4-7- مقایسه میانگین مدت زمان عدم تحرک در آزمون شنای اجباری در روز دوم بین موش­های نر گروه کنترل و دریافت کننده ساخارین و اتوسوکسیماید.

 

بین سه گروه تفاوت معنی­داری مشاهده نشد.

مدت زمان بی­حرکت ماندن در روز دوم آزمون شنای اجباری در ماده­های گروه دریافت کننده ساخارین نسبت به گروه کنترل از نظر آماری کاهش معنی­داری نشان داد (P<0.05). مدت زمان بی­حرکت ماندن در روز دوم آزمون شنای اجباری در ماده­های گروه دریافت کننده اتوسوکسیماید نسبت به گروه دریافت کننده ساخارین از نظر آماری افزایش معنی­داری نشان داد (P<0.05). (نمودار 4-8).