پپتیدهای ضدمیکروبی با توجه به منشاشان به چهار گروه تقسیم بندی می­شوند:۱- حشرات ۲- دیگر حیوانات ۳- شیمیایی ۴- از طریق میکروارگانیسم­های مهندسی شده تولید می­شوند. امروزه بیش از ۱۵۰۰ پپتید ضدمیکروبی از منشاهای متفاوت گزارش شده است (Varadhachary and Gauri, 2010).

 

۲-۳-۱- پپتید های ضد میکروبی با منشا حشرات

این نوع پپتیدها هم القایی هستند و هم به صورت همیشه بیان می­باشند. امروزه بیش از ۲۰۰ پپتید در حشرات شناسایی شده این پپتید­ها به پنج گروه بر اساس توالی اسید آمینه و فعالیت آنتی باکتریایی تقسیم بندی می شوند. که عبارتند از سکروپین­ها، دفنسین حشرات، پپتید غنی از پرولین، پپتیدهای غنی از گلیسین و لیزوزیم­ها(Li et al., 2012) .

 

۲-۳-۲- پپتیدهای ضد میکروبی شناسایی شده در دیگر حیوانات

این پپتیدها توالی متنوع، ساختار و بافت هدف خاصی را نشان می­دهند. بیان این پپتیدها در اکثر بافت­ها و انواع مختلفی از سلول­ها و سطح گسترده­ای از انواع گونه­ های مختلف شامل PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران، دوزیستان و ماهی­ها بیان می شوند. در بیشتر مهره­داران با یک لایه­ی دایره­ای خنثی حفظ می­ شود (Li et al., ۲۰۱۲).

 

۲-۳-۳ – پپتید های ضد میکروبی حاصل از سنتز مصنوعی

سنتز مصنوعی با بهره گرفتن از روش فاز جامد انجام می­گیرد که در این روش ابتدا اسید آمینه­ای که انتهای آن دارای انتهای آمینی می­باشد، محافظت شده به فاز جامد متصل می­ شود سپس مولکولی که به قسمت انتهای آمینی چسبیده برداشته شده و اسید آمینه­ی دیگر اضافه شده و به همین ترتیب ادامه داده تا پپتید مورد نظر ساخته شود. ازجمله مشکلات سر راه در سنتز پپتید هزینه­ زیاد، وجود باندهای دی­سولفیدی و تغییرات پس از ترجمه می باشد (Wang et al., 2012).

 

۲-۳-۴- پپتیدهای ضد میکروبی حاصل از میکروارگانیسم­های مهندسی شده

پیشرفت در تکنولوژی DNAی نوترکیب فرصتی را برای تولید AMPها در مقیاس وسیع فراهم کرده است. این تکنولوژی قادر است ژن بیگانه را در ناقل های مخصوص جاسازی و در پروکاریوت­ها و سلول­های یوکاریوت میزبان بیان کند. با توجه به اینکه موثرترین روش برای صرفه­جویی در زمان و کاهش هزینه می­باشد و علاوه بر این تولید پپتید با بهره گرفتن از تکنیک زیست مولکولی می ­تواند در بخش­های مختلف صنعتی به کاررود (Rao et al., 2005). با توجه به اندازه­ پپتید، جایگاه و ترشح داخل سلولی پپتید، نحوه­ تاخورده­گی و الگوهای قنددار شدن پپتیدها، میزبان‌های متفاوتی وجود دارد. باکتری­ ها و مخمرها ۹۶ درصد میزبان­ها را در تولید AMPها به خود اختصاص دادند و درحالی که گیاهان نقش کمرنگ تری در تولید AMP ها دارند (Parachin et al., 2012).

 

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

۲-۳-۴-۱- باکتری ها

باکتری Esheria coliیکی از پر کاربردترین میکرو ارگانیسم­­ها برای تولید پپتیدهای ضد میکروبی می­باشند که به دلیل رشد سریع، دسترسی به ناقل های بیانی تجاری، وجود دانش وسیع در حیطه­ی ژنتیک، بیوشیمی و فیزیولوژی را به خود اختصاص داده است. بعد از E.coli باکتری Bacillus subtillusبیشترین کاربرد برای بیان AMP را به خود اختصاص داده است (Ingham and Moore, 2007) که از جمله­ آن می توان سکروپین AD نام برد (Feng et al., 2012). تولید AMP در باکتری­ ها با چند چالش روبرو می­باشد، از جمله­­ می توان، جلوگیری از فعالیت طبیعی AMP به دلیل سمی بودن برای باکتری و ناپایداری AMP به علت خواص شیمیایی و اندازه­ آن نام برد. بنابراین برای بدست آوردن بیان موفقAMP از یک پروتئین حامل که خاصیت آنیونی پپتید را خنثی کند می­توان از پروتئین حامل استفاده کرد، علاوه بر این، پروتئین حامل حلالیت AMP را تسهیل کرده است (Li et al., 2012).

 

۲-۳-۴-۲- مخمرها

مخمرهایی مانند Saccharomyces cerevisiae و Pichia pastoris از جمله میزبان­های مناسب برای تولید AMPها می باشند (Cregg et al., 2009). مخمرها مزایایی نسبت به پروکاریوت­ها دارند که عبارتند از: دارای تغییرات پس از ترجمه هستند، هزینه­ کمتر و رشد سریعتر در مقایسه با کشت سلول­های PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران دارند که نتیجه­ آن تولید پروتئین بیشتر و مناسب­تر می­باشد و در نهایت اینکه مخمر ها قادرند AMPمورد نظر را به بیرون ترشح ­کنند که خالص­سازی و جداسازی را آسان می­ کند (Atiqur et al., 2010). برای مثال تولید AMPی Shrimp paenedin در S.cerevisiae انجام شد ولی سطح تولیدی گزارش نشد در حالی که درP .pastoris مقدار mg/l-1180 تولید شد. دلیل آن این است که P. pastoris دارای مقاومت نسبت به الکل می باشد و محیط اطراف خود را تخمیری نمی­ کند بنایراین می تواند سطح بالایی از پپتید را تولید کند (Cereghino et al., 2002).

 

۲-۳-۴-۳- گیاهان

تغییرات ژنتیکی گیاهان پیشرفت بزرگی را در بهبود و اصلاح محصولات و کیفیت مواد غذایی گیاهان به ارمغان آورده است، از جمله گیاهانی مانند سویا، ذرت، کتان و برنج می توان اشاره کرد و این گیاهان به مدت طولانی برای بیان پپتید استفاده می­شوند (Desai et al., 2010). در واقع تغییرات ژنتیکی گیاهان برای بیان پروتئین بیگانه و پپتید به طور عمده برای اصلاح محصولات انجام شده است، اما هیچ تلاش موثری در تعیین مقدار کمی AMPی نوترکیب انجام نشده است. در حال حاضر با توجه به فعالیت طبیعی AMPها از بیان آن­ها در سیستم­های میکروبی ممانعت می­ شود (Delaunios et al., 2009).
همانطور که قبلا توضیح داده شد هدف از بیانAMPها در گیاهان بیشتر برای مقاوم کردن آنها به بیماری­های ویروسی، باکتریایی و قارچی بوده است. بیان پروتئین دفنسین Rs-AFP2 در تربچه، گوجه و توتون باعث مقاومت در برابر بیماری قارچی Alternaria longipes شد (Terras et al., 1995).
پپتید ضد قارچی آلفا آلفا[۹] بیماری پژمرده­گی ورتیسلیومی سیب زمینی را نسبتا کنترل کرده (Gao et al., 2010). بیان ژن لاکتوفرین در کالوس‌های تراریخت و استخراج پروتئین کل خاصیت ضد باکتریایی علیه ۴ باکتری را نشان داد و علاوه بر این که منجر به مقاومت گیاه علیه باکتری می­ شود. لاکتوفرین آهن را از دسترس باکتری دور کرده و باعث کم شدن جمعیت باکتری شده است (Mitra et al.,1994). بیان ژن لاکتوفرین در گیاه توتون باعث مقاومت نسبی علیه باکتریR. solanacerum در مقایسه با تیپ وحشی شد که احتمالا دلیل آن وجود لاین های مختلف ژنتیکی، وجود کپی­های متفاوت در گیاهان تراریخت و جایگاه قطعه­ی مورد نظر در گیاه است (Zhang et al., 1998). ژن سکروپین در گیاه توتون علیه باکتری Pseudomonas syringae pv. Tabaci بیان شد و گیاه تراریخت فقط در رقت­های۱۰۵ و ۱۰۶ این باکتری نکروز نشان داد درحالی که در رقت­های۱۰۳ و ۱۰۴ هیچ­گونه علایم نکروزی مشاهده نشد (Haung et al., 2009). پپتید ضد میکروبی می ­تواند به عنوان عامل درمانی علیه باکتری­ ها و ویروس­ها استفاده شود. بیان ژن اسپروتگرین[۱۰] در کلروپلاست گیاه توتون باعث مقاومت علیه باکتری Erwinia carotovorra و ویروس موزاییک توتون شد (Lee et al., 2011). پپتید ضد میکروبی پپتیبول[۱۱] با خاصیت ضد ویروسی علیه ویروس موزاییک توتون استفاده شد و باعث تحریک آنزیم­ هایی مانند پروکسیداز[۱۲]، آمونیالیاز[۱۳] و فنیل آلانین[۱۴] و همچنین بیان ژن­های درگیر در مسیر فوق حساسیت نقش دارند، شد (Yan et al., 2012). تاناتین[۱۵] نوعی پپتید ضد میکروبی که فعالیت ضدرذمیکروبی وسیعی علیه باکتری، قارچی و ویروسی نشان داده است بیان ژن این پپتید در گیاه آرابیدوپسیس باعث مقاومت علیه قارچ Botrytis cinerea و Powdery Mildew و باکتری P. syringae شد (Yan et al., 2010). امروزه بیان ژن پپتیدهای ضد میکروبی غیر گیاهی در گیاهان تراریخت دارای پتانسیل بالایی برای مبازه با بیماری­های باکتریایی هستند.

 

۲-۴- ۱- معرفی لاکتوفرین

لاکتوفرین یک گلیکوپروتئین متصل شونده به آهن و از خانواده ترانسفرین است، که اولین بار از شیر گاو جداسازی شد (Sorensen and Sorensen, 1939).

 

۲-۴-۲- بررسی ساختار ژنی لاکتوفرین

سه ایزوفرم از لاکتوفرین شناسایی شده است که دو ایزوفرم فعالیت نوکلئازی دارند و یک ایزوفرم بدون فعالیت نوکلئازی می­باشد. ژن لاکتوفرین ۲۳ تا ۲۵ کیلوباز بوده و شامل ۱۷ اگزون است که در PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران مختلف تفاوت های جزئی دارند. توالی یابی ژن لاکتوفرین شتر نیز انجام شده و توالی mRNA آن در Genbank با شماره‌های AF165879 و AJ131674 در دسترس است. ژن لاکتوفرین در گونه‌های نزدیک بسیار حفاظت بوده و طول ORF[16] آن در موجودات مختلف بین ۱۹۰۰ تا ۲۶۰۰ جفت باز است و طول ORF لاکتوفرین شتر ۲۱۲۴ جفت باز است (Levay et al., 1995).

 

۲-۴-۳- ویژگی پروتئین لاکتوفرین

لاکتوفرین یک پروتئینی با وزن مولکولی ۷۵ تا ۸۰ کیلو دالتون است و دارای ۷۰۰ تا ۷۲۰ آمینواسید است. این ژن دارای شباهت بالایی بین گونه های مختلف است. این پروتئین دارای بار خالص مثبت است و به علت وجود ریشه های سیستئین دارای پل‌های دی‌سولفیدی در ساختار خود می باشد، این پروتئین همچنین دارای چهار محل اتصال قند و نقطه‌ی ایزوالکتریک ۸ تا ۵/۸ است. زنجیره‌ی پلی‌پپتیدی در این پروتئین‌ها از دو لوپ با شباهت بالا به نام‌های N و C لوپ تشکیل شده است و دو لوپ این پروتئین بوسیله یک مارپیچ آلفا بهم متصل شده که باعث انعطاف‌پذیری پروتئین می شوند (Oztas et al., 2005; Khan and Marks, 2001).
لاکتوفرین دارای توانایی اتصال به یون‌های آهن، روی، مس و منگنز است و هر لوپ می تواند به یون کربنات نیز متصل شود. همچنین به علت بار مثبت دارای قابلیت اتصال به لیپوساکاریدها(Makovitzki et al., 2007) لیپوتایکویک اسید، هپارین سولفات، DNA و RNA می­باشد (Baker and Edward, 2004) .به دلیل توانایی اتصال قابل برگشت با آهن، لاکتوفرین می تواند به شکل بدون آهن یا همراه با آهن باشد و بسته به اینکه به آهن متصل باشد یا خیر ساختار سه بعدی متفاوتی دارد (Oztas et al., 2005).

 

۲-۴-۴- نقش پروتئین لاکتوفرین

پروتئین لاکتوفرین مانند دیگر اعضای خانواده ترانسفرین­ها در نقل و انتقال و هموستازی آهن در بافت­ها دخیل هستند. ویژگی ساختاری لاکتوفرین نقش­های ساختاری دیگری را علاوه بر نقش آن در هموستازی آهن برای ان ایجاد کرده است. لاکتوفرین به عنوان جزء ذاتی سیستم ایمنی مطرح بوده است. و اولین سد دفاعی را در برابر میکروب­ها نشان می­باشد و دامنه‌ی وسیعی از فعالیت های زیستی مانند فعالیت ضد قارچی، ضد باکتریایی، ضد ویروسی، ضد انگلی، ضد التهابی، ضد درد، تنظیم سیستم ایمنی، تنظیم بیان ژن و ضد سرطانی را شامل می­ شود(Baker and Edward, 2004). لاکتوفرین در تمام مایعات ترشحی وجود دارد ولی بیشترن میزان بیان آن در بافت PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)ی بوده و شیر مقادیر بالایی از لاکتوفرین را دارا می باشد. به دلیل موقعیت خاصی که در سطح موکوسی دارد اولین سد دفاعی در برابر حملات میکروبی است. لاکتوفرین رشد و تکثیر عوامل متعدد بیماریزا شامل باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی، ویروس‌ها، پروتوزوآها و قارچ‌‌ها را محدود می کند (Li et al., 2008).

 

۲-۴-۵- فعالیت ضد قارچی و ضد باکتریایی پروتئین لاکتوفرین

پروتئین لاکتوفرین با جذب آهن آزاد، محیط را عاری از این عنصر می‌کند و در نتیجه باکتری­ ها و قارچ‌هایی که برای زندگی رشد و تکثیر خود به آهن نیاز دارند قادر به ادامه‌ی رشد نیستند بنابراین بیان فاکتورهای بیماری‌زای آنها کاهش می‌یابد (Crosa, 1989). بعضی از گونه های باکتریایی با ترشح موادی مانند سیدروفورها می توانند آهن را از لاکتوفرین جدا کنند و مورد استفاده قرار دهند. بنابراین لاکتوفرین با مکانیسم‌های دیگری از رشد این میکرواورگانیسم‌ها جلوگیری می­ کند (Arnold et al., 1988). در این مورد لاکتوفرین از طریق برهم­کنش مستقیم با سطوح باکتری و قارچ باعث از بین رفتن این میکروارگانیسم­ها می‌شود (Adlerova et al., 2008).
بار مثبت انتهای آمینی لاکتوفرین از برهمکنش لیپوپلی­ساکاریدها با کاتیون‌های منیزیم و کلسیم غشای باکتریایی جلوگیری کرده و باعث آزاد شدن لیپوپلی‌ساکارید‌ها و همچنین باعث افزایش تاثیر دیگر ترکیبات ضد میکروبی مانند لیزوزیم همراه با لاکتوفرین می شود (Rao et al., 2005). اثر لاکتوفرین بر باکتری‌های گرم مثبت بر مبنای برهم­کنش بار مثبت آن با مولکول‌های آنیونی موجود بر سطوح غشای باکتریی می باشد مانند لیپوتیکوئیک‌اسید ، که حاصل این برهم­کنش کاهش بار منفی موجود در دیواره‌ی سلولی و مساعد شدن شرایط برای عمل لیزوزیم بر روی این سطوح است (Adlerova et al., 2008).

 

۲-۴-۶- فعالیت ضد ویروسی پروتئین لاکتوفرین

پروتئین لاکتوفرین علیه طیف وسیعی از ویروس‌های RNA و DNAدار فعالیت دارد. مکانیسم این اثر هنوز به طور کامل شناسایی نشده است. یکی از فرضیه ­های پذیرفته شده در این زمینه این است که لاکتوفرین با اتصال به گیرنده‌های ویروسی سطح سلولی گلیکوزآمینوگلیکان مانند هپارین سولفات‌ها از اتصال ویروس به سلول میزبان جلوگیری می‌کند (Ikeda et al., 2000 ; Levay et al., 1995). مطالعات این ویترو[۱۷] نشان می دهد که در میان پروتئین های پلاسما و خون انسان، لاکتوفرین قویترین فعالیت بر علیه ویروسHIV را دارد (Swart et al.,1996).

 

۲-۴-۷- فعالیت ضد سرطانی پروتئین لاکتوفرین

خواص ضد توموری لاکتوفرین در حدود یک دهه پیش کشف شده و توسط مطالعات آزمایشگاهی گسترده­ای تایید شده است. استفاده خوراکی لاکتوفرین گاوی در جوندگان به طور معنی داری تومورزایی را کاهش داد (Bezault, 1994). لاکتوفرین دارای خواص آنتی متاستاز[۱۸]بوده و با القا آپوپتوز از رشد تومورهای پیوندی جلوگیری می‌کند (Varadhachary et al., 2006). لاکتوفرین تولید سیتوکینین را در سرطان تنظیم می کند. (Oztas et al., 2005).

 

۲-۵- ویروس موزاییک خیار (Cucumber Mosaic Virus)

کوکوموویروس[۱۹] ها نام عمومی خود را از ویروس موزاییک خیار گرفته اند. پیکره ی ویروس جورترا به قطر ۲۶-۳۵ نانومتر است (اگریوس، ۱۳۸۹). هر یک از دو RNAی ژنومی (RAN1, RNA2) در پیکره ای جداگانه قرار دارند. RNA3 و RNAی زیر ژنومی در پیکره ی سوم قرار دارند. این ویروس پراکنش جهانی دارد. بسیاری از سبزی­ها، گیاهان زینتی، علف­های هرز و سایر گیاهان آلوده می­ کند. ویروس موزاییک خیار باعث ایجاد بد برگی، بد شکلی برگ، گل و میوه در گیاهان می­ شود. اندازه­ بوته­ های آلوده کاهش یافته و حتی از بین می روند. کنترل کوکوموویروس­ها مشکل است و عمدتا برای پیشگیری از ابتلا به بیماری ویروسی بر مبنای تولید و استفاده از ارقام مقاوم می­باشد. استفاده ار بذر و نشای عاری از ویروس از بین بردن میزبان­های وحشی حامل انتقالی ویروس راه مقابله با ویروس می باشد (اگریوس، ۱۳۸۹).

 

۲-۶- پژمردگی جنوبی باکتریایی گیاهان تیره سولاناسه

پژمردگی باکتریایی گیاهان تیره ی سولاناسه بر اثر R.solonacerum ایجاد می شود. بیماری در مناطق گرمسیری و در آب و هوای گرم در سراسر جهان وجود دارد. بیماری موجب خسارت های شدید در توتون، گوجه فرنگی، سیب زمینی و بادمجان در بعضی از مناطق گرم خارج از نواحی گرمسیر می شود. دست کم پنج نژاد بیمارگر وجود دارد که روی میزبان­های مختلف بیماری ایجاد می کند. یکی از آن­ها به تمام محصولات تیره­ی سولاناسه[۲۰]، بسیاری از گیاهان غیر سولاناسه، بعضی از موز ها حمله می کند. نژاد دوم فقط به موز حمله می کند. نژاد سوم فقط به سیب زمینی و توتون حمله می­ کند و دو نژاد دیگر روی گیاهان کم اهمیت بیماری ایجاد می­ کنند. پژمردگی باکتریایی روی گیاهان تیره­ی سولاناسه به صورت پژمردگی ناگهانی ظاهر می شود. گیاهان جوان آلوده به سرعت از بین می­روند. بافت های آوندی ساقه، ریشه و غده قهوه­ای و در مقطع عرضی آن­ها ترشحات مایل به سفیدی باکتریایی دیده می شود. کنترل بیماری با بهره گرفتن از واریته­های مقاوم و تناوب زراعی مناسب یا آیش گذاشتن زمین وابسته است و مواد تکثیری عاری از ویروس باید تهیه کرد (اگریوس، ۱۳۸۹).
فصل سوم

 

۳- مواد و روش­ها

 

۳-۱- مواد گیاهی

به منظور حذف تمام آلودگی­ها کلیه­ وسایل مورد نیاز شامل پنس، اسکالپل و کاغذ صافی اتوکلاو شدند. بذر توتون­های تراریخت رقم var xanthi N. tabocco در محلول ضدعفونی کننده­ (جدول ۳-۱) به مدت ۵ دقیقه به آرامی تکان داده شدند، سپس ۵ بار با آب مقطر سترون شسته شدند سپس بذرها خشک شده و روی محیط کشت [۲۱]MS حاوی کانامایسین ۱% کشت داده شدند. گیاهچه­های ۳ تا ۴ برگی به لیوان های حاوی کوکوپیت و پرلایت انتقال داده شدند و آن­ها را در شرایط نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی و دمای ۲۵ سانتی گراد قرار دادند و هر هفته باMS مایع آبیاری شدند.
جدول ۳-۱ محول ضدعفونی کننده بذر توتون

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ماده مقدار بر حسب میکرولیتر
وایتکس ۳۰۰
ترایتون ایکس ۱۰۰ ۶
آب مقطر سترون ۷۰۰

۳-۲- مایع زنی ویروس موزاییک خیار به توتون رقم زانتا

دو گرم از بافت برگ حاوی منبع ویروسی [۲۲]CMV که قبلا با الایزا وجود آن تایید شده بود را در دو برابر حجم بافر فسفات له می­کنیم. سپس کاربراندوم را روی سطح برگ های سن ۸-۱۰ روزه ­پاشیده تا در سطح برگ زخم ایجاد شود و بعد از آن عصاره­ی حاوی ویروس روی سطح برگ مالیده شد. بعد از ۱۶ روز وجود علایم در گیاهان تیپ وحشی و تراریخت بررسی شد. این آزمایش با سه بار تکرار انجام شد.

 

۳-۳- واکنش گیاهان تراریخت و تیپ وحشی به ویروس موزاییک خیار

مایه زنی ویروس موزاییک خیار به توتون­های تراریخت و تیپ وحشی انجام شد و پس از دیدن علایم در گیاهان تیپ وحشی­ در سه زمان متفاوت شامل ۱۵، ۲۰ و ۳۰ روز بعد از مایه زنی ویروس موزاییک خیار از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی نمونه برداری انجام شد. بعد از دیدن علایم در گیاهان تیپ وحشی­ به مدت دو ماه روند شدت علایم را در گیاهان تراریخت­ مشاهده و ثبت شد.

 

۳-۴- آزمون الایزا برای ویروس موزاییک خیار

بعد از مشاهده­ علایم و برای اندازه ­گیری جذب نوری ویروس درگیاهان تیپ وحشی و تراریخت ۲ /۰ گرم از بافت برگی ­برداشت شد و در حاون عصاره­ گیری شد. سپس سانتریفیوژ به مدت ۳ دقیقه با دورxg 3000 انجام شد و ۵۰ میکرومول از عصاره و ۵۰ میکرومول از بافر PVP در پلیت الایزا ریخته و در دمای ۴ درجه سانتی گراد به مدت ۴ ساعت قرار داده شد. سپس سه مرتبه با بافرشستشو داده شد و آنتی بادی ویروس موزاییک خیار به آن اضافه شد و در در دمای ۳۷ درجه به مدت ۴ ساعت قرار داده. مجددا سه مرتبه با بافر شستشو داده شد و سپس آنتی ربیت اضافه شد و ۴ ساعت در دمای ۴ درجه قرار داده شد و با بافر شستشو داده شد در نهایت به آن سوبسترای آنزیم اضافه شد و جذب نوری ویروس در گیاهان تیپ وحشی و تراریخت با بهره گرفتن از دستگاه Elisa Reader تعین شد. و سپس داده ­ها با بهره گرفتن از نرم افزار MINITAB 17 در طرح کاملا تصادفی تجزیه و تحلیل شدند.