۴-۵-۱- انجام Real Time PCR برای ژن لاکتوفرین ۴۲
ویروس موزاییک خیار ۴۳
۴- ۴۶
۶- بحث ۴۷
۷- منابع ۴۹
فهرست جدول‌ها
عنوان …………. صفحه
جدول ۳-۱- محول ضدعفونی کننده بذر توتون ۱۶
جدول ۳-۲- تهیه ی بافر استخراج DNA 19
جدول ۳-۳- پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر و تایید ژن لاکتوفرین ۲۰
جدول ۳-۴- سیکل گرمایی استفاده شده در هر واکنشPCR 21
جدول ۳-۵- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR 22
جدول ۳-۶- نوع و میزان مواد به کار رفته برای تیمار DNase 25
جدول ۳-۷- مواد مورد استفاده در مرحله اول سنتز cDNA 26
جدول ۳-۸- مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتز cDNA 27
جدول ۳-۹- آغازگرهای به کار رفته ژن لاکتوفرین برای Real-Time PCR و ژن کنترل داخلی ۲۷
جدول ۳-۱۰- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی…… ۲۸
جدول ۳-۱۱- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن کنترل داخلی ۲۹
ویروس موزاییک خیار و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی ۳۰
ویروس موزاییک خیار و ژن کنترل داخلی ۳۰
جدول ۴-۱- تاخیر ظهور علایم پس از ۱۵ روز از مایه زنی ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت ۳۶
فهرست شکل ها
عنوان……………………………………………………………………………………………………………………………… صفحه
شکل ۴-۱- ظهور علایم در توتون های تیپ وحشی ۳۳
شکل ۴-۲- گیاهان تراریخت هنگام ظهور علایم در تیپ وحشی‌ها ۳۴
شکل ۴-۳- گیاهان تیپ وحشی بعد از ۳۰ روز مایه زنی ویروس موزاییک خیار ۳۴
شکل ۴-۴- گیاهان تراریخت پس از ۱۵ روز از ظهور علایم در تیپ وحشی­ها ۳۵
شکل ۴-۵- آزمون الایزا در زمان صفر ۳۷
شکل ۴-۶- رشد ویروس در تراریخت ها و تیپ وحشی در ۲۰ روز بعد ازمایه زنی ویروس موزاییک خیار ۳۸
شکل ۴-۷- آزمون الایزا در زمان ۳۰ روز بعد مایه زنی ویروس موزاییک خیار ۳۹
شکل ۴-۸- نقوش الکتوفروزی محصول PCR با پرایمرهای partial ژن لاکتوفرین ۴۰
شکل ۴-۹- استخراج RNA از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی ۴۰
شکل ۴-۱۰- نقوش الکتروفورز PCR آغازگرهای Real-Time با آغازگرهای ژن لاکتوفرین: ۴۱
شکل ۴-۱۱- تیمار DNase توتون تیپ وحشی پس از ۲۲ روز از مایه زنی باکتری ۴۱
شکل ۴-۱۲- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن لاکتوفرین در لاین­های تراریخت ۴۲
ویروس موزاییک خیار ۴۳
شکل ۴-۱۴- کشت عصاره ی حاصل از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی ۴۴
شکل ۴-۱۵- پژمرده گی گوجه پس از ۲۶ روز از مایه زنی باکتری ۴۵
۴۵
۴۵
فصل اول

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

۱-­ مقدمه

براساس یک تخمین محافظه کارانه، بیماری­ها، حشرات و علف های هرز در سطح جهانی سالانه بین ۳۱ تا ۴۲% محصولات کشاورزی را نابود کرده و یا از تولید آن­ها جلوگیری می­ کنند. میزان خسارت به طور معمول در کشورهای پیشرفته و در کشورهای در حال پیشرفت که نیاز غذایی بیشتری دارند، بالاتر است (Tisdell and Xiang, 1998). اگر متوسط میزان خسارت را ۵/۳۶% بگیریم، سهم بیماری ها، حشرات و علف های هرز دراین خسارت به ترتیب ۱/۱۴%، ۲/۱۰% و ۲/۱۲% شده است. با توجه به اینکه بیماری ها به تنهایی موجب نابودی ۱/۱۴% محصولات می شوند، مقدار خسارت سالانه آن­ها در سطح جهانی بالغ بر۲۲۰ میلیارد دلار می شود (Wood and Derek, 2001).
طی یک صد سال گذشته، کنترل بیماری­ها و سایر آفات گیاهی به طور فزاینده­ای به استعمال مواد شیمیایی سمی وابسته است. کنترل بیماری­های گیاهی اغلب کاربرد این مواد سمی را نه تنها بر روی گیاه و محصولات گیاهی مورد استفاده­ی ما، بلکه درون خاک جایی که بسیاری از میکروارگانیزم­های بیماری­زا زندگی کرده و به ریشه­ گیاه حمله می­ کنند، ضروری ساخته است. بسیاری از این مواد شیمیایی برای میکروارگانیزم­های غیر هدف، حیوانات و حتی برای انسان نیز ممکن است سمی باشند. دشوار است که بتوان هزینه­ های بلند مدت و کوتاه مدت آلودگی محیط زیست بر سلامتی و به­زیستی انسان را که براثر تلاش ما برای کنترل بیماری های گیاهی و سایر آفات به وجود می آید، تخمین زد. شمار زیادی از بیمارگرهای گیاهی از ویروئیدهای دارای چند صد نوکلئوتیدی تا گیاهان عالی در محصولات کشاورزی ایجاد بیماری می­ کنند. دامنه­ اثرات این بیماری زا از اثرات خفیف تا نابودی کامل محصول است. گروه­های عمده بیمارگرها شامل ویروس­ها، باکتری­ ها، قارچ­ها، اوومیست­ها، ویروس­ها و نماتدها می­باشند. کنترل عوامل بیماری­زای گیاهی مشکل است زیرا جمعیت آنها بسته به زمان، مکان و نوع ژنوتیپ متغیر است. بنابراین برای مبارزه با تلفاتی که آن­ها به وجود می ­آورند، لازم است به تعریف مشکل پرداخت و به دنبال راه­حل­هایی بود. در سطح زیستی نیاز به روش­هایی برای تشخیص دقیق و سریع اورگانیزم ایجاد کننده­ی، بیماری تخمین دقیق شدت بیماری، اثر بیماری روی محصول و تشخیص مکانیسم ­های بیماری­زایی می­باشد. در مرحله­ بعد خسارت بیماری باید به وسیله­ کاهش مایه تلقیح بیمارگر، کاهش مکانیسم های بیماری­زایی آن و افزایش گوناگونی ژنتیکی در محصول به حداقل برسد (Reed et al., 2003). هدف بیشتر پژوهش­های جدید در بیماری­شناسی گیاهی یافتن شیوه ­های دیگر برای کنترل بیماری­های گیاهی است که به محیط زیست آسیب کمتری برسانند. روش­های انتقال در سال­های اخیر به عنوان یک موضوع مهم برای ایجاد مقاومت مورد بررسی قرار گرفته است. امید ­بخش­ترین این روش­ها عبارتند از:
عکس مرتبط با محیط زیست

تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق مهندسی ژنتیک

تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق به­نژادی گیاهی سنتی

کاربرد فنون زراعی برای سرکوب بیماری

کاربرد فنون خاموشی ژن

استفاده از مواد غیر سمی افزایش دهنده مقاومت

بهره­وری از عوامل زیستی ناهمساز به میکرواورگانیزم­های مولد بیماری (ایزدپناه و همکاران، ۱۳۸۹ و Strange et al., ۲۰۰۵)

با توجه به ضرورت ارقام گیاهی مقاوم به تنش­های زیستی و غیر زیستی و نارسایی روش­های سنتی به­نژادی گیاهی، به کارگیری روش­های موثر تنها راه برون رفت از این مشکل می­باشد. در سال­های اخیر، با پیشرفت بدست آمده از در زیست شناسی مولکولی و روش­های کشت بافتی گیاهی روش­های جدیدتر و کارآمدتری را در مهندسی ژنتیک، برای چیره­گی بر محدودیت­های به­نژادی گیاهی سنتی فراهم کرده است. بنابراین استفاده از مهندسی ژنتیک برای دستیابی به ارقام مفید می باشد. با بهره گرفتن از فنون انتقال ژن، گیاهان تراریخت با یک ویژگی مشخص می توانند یک ژن از منبع ژنی متفاوت دریافت نمایند به نحوی که سایر ویژگی­های مطلوب گیاه تحت تاثیر قرار نگیرد. بنابراین ­کاربرد سموم شیمیایی هنوز موثرترین روش برای کنترل بیماری­های گیاهی هستند، اما کاربرد بیش از اندازه­ باکتری­کش‌ها و قارچ­کش­ها­ی شیمیایی منجر به شدید شدن و طولانی شدن دوره­ های آلودگی محیط زیست و مقاوم شدن بیمارگرها نسبت به این سموم شده است (Daoubi et al., 2005). اگرچه روش­های اصلاحی یکی از موثرترین راهکارها در تولید گیاهان مقاوم به بیماری­ها بوده اما این روش دارای محدودیت­هایی مانند فقدان پل ژنی دهنده مناسب و شکستن مقاومت می­باشد. از سوی دیگر روش­های بیوتکنولوژی به طور موفقیت­آمیزی در تولید محصولات گیاهی مقاوم علیه بیمارگرها و آفات موثر بوده است، در این روش­ها ژن بیان کننده­ پپتید­های ضدمیکروبی را در گیاهان بیان کرده و باعث مقاومت گیاه به بیماری مورد نظر شده است (Tingquan et al., 2013).

۱-۱- ­ پپتیدهای ضد میکروبی

پپتیدهای ضد میکروبی یکی از اجزای سیستم ذاتی ایمنی محسوب می­ شود که معمولا به عنوان اولین خط دفاعی علیه پاتوژن­ها عمل می­ کنند. چند ویژگی که معمولا در همه­ی پپتید­های ضد عمومیت دارد شامل: توالی کوتاه بین ۳۰ تا۶۰ اسید آمینه آمینه، خاصیت کاتیونی قوی، قابلیت تحمل دما تا ۱۰۰ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه می­باشد. پپتیدهای ضد میکروبی بوسیله­ موجودات مختلف تولید می­شوند که شامل باکتری­ ها حشرات، گیاهان و مهره داران می باشد (Boulanger et al., 2006). پپتید­های ضد میکروبی طیف وسیعی از میکروارگانیسم­ها شامل باکتری­ های گرم مثبت و گرم منفی، قارچ­ها، میکروپلاسماها و ویروس­ها را کنترل می­ کنند. بیش از ۱۵۰۰ پپتید ضد میکروبی در جانوران، گیاهان و میکروارگانیسم­ها شناسایی شده است (Parachin et al., 2012 ; Li et al., 2012).
بیان ژن­های کد کننده­ پپتیدهای ضدمیکروبی با منشا گیاهی در گیاهان تراریخته باعث تغییر کمی در مقاومت گیاه علیه بیمارگرهای گیاهی می شود، زیرا بیمارگر با گیاه در یک مدت طولانی با هم تکامل یافته­اند اما بیان ژن های کد کننده­ یپپتیدهای ضدمیکروبی از منابع دیگر در گیاهان منجر به سطح بالایی از مقاومت در برابر طیف وسیعی از بیماری­ها شده است (Burrowes et al., 2005).

۱-۲- پروتئین لاکتوفرین

پروتئین لاکتوفرین یکی از اعضای خانواده­ی ترانسفرین ها می باشد که دارای خاصیت اتصال شونده­گی به آهن است. لاکتوفرین­ها اغلب آمفی­پاتیک حاوی بار مثبت و مناطق هیدروفیل هستند که به دومین مولکول­های حاوی بار منفی در سطح میکرواورگانیسم متصل می­شوند که این مکانیسم به لاکتوفرین اجازه می­دهد به راحتی با غشا باکتری که شامل مجموعه ­ای از مولکول­های آمفی­پاتیک می­باشد، واکنش دهد، مخصوصا با باکتری­ هایی که سطح غشا آن­ها دارای بار منفی می­باشند (Legrand and Mazurier, 2010 ).

۱-۳- هدف

در این پروژه بیمارگرهای باکتریایی و ویروسی به گیاهان ترایخت نسل دوم توتون حاوی ژن لاکتوفرین شتر عربی با هدف ایجاد مقاومت توتون­های تراریخت نسبت به این بیمارگرها مایه­زنی گردید.
فصل دوم

۲- مروری بر پژوهش­های پیشین

۲-۱- بیماری­های گیاهی و مهند سی ژنتیک

با تشخیص القای تومور درگیاهان توسط Agrobacterium tumefaciens به­واسطه­ انتقال T-DNA موجود روی پلاسمید باکتری ایجاد می­ شود، کاربرد از آن برای ایجاد گیاهان تراریخت معمول شده است. اگر چه از تکنیک­های دیگری مانند الکتروپوراسیون[۱] و بیولیستیک[۲] نیز استفاده می­ شود. روش های سنتی به­نژادی گیاهان شامل تلاقی­های مختلف و روش­های درون شیشه ­ای مکمل این روش­ها در ایجاد گیاهان با صفات مطلوب می­باشند. در سال­های اخیر ظهور روش­های مهندسی ژنتیک به عنوان ابزاری جدید در تحقیقات کشاورزی همسو با به­نژادی سنتی در گسترش روش­های جدید برای دستورزی ژنتیکی گیاهان نقش بسیار مهمی ایفا کرده است. یکی از شاخه­های زیست فناوری گیاهی انتقال ژن­های خاص به سلول­های گیاهی و یا بازایی گیاه از این سلول‌ها با بهره گرفتن از روش­های کشت بافت گیاه می­باشد. بنابراین زیست فناوری این پتانسیل را دارد که با تولید گیاهان با خصوصیات بهبود یافته مکمل روش­ها­ی سنتی به نژادی گیاهان شود. بر خلاف روش­های به نژادی سنتی که در آّن دسته­ای از ژن­ها منتقل می­ شود (Wood and Derek, 2001). در روش­های مبتنی بر زیست فناوری می­توان یک ژن مشخص را از هر موجودی انتخاب و به جاندار دیگر انتقال داد. سوالی که در روش­ها­ی مهندسی ژنتیک مطرح می­ شود این است که چه ژن­های باید منتقل شوند که پاسخ به این سوال بستگی به نوع هدفی که در انتقال ژن دنبال می شود، دارد. در مبارزه با بیماری­ها با بهره گرفتن از مهندسی ژنتیک دسته اول ژن­های کاندیدا برای انتقال ژن­های هستند که ویژگی­های بیماری­زای بیمارگر به عنوان مثال آنزیم­ های تجزیه کننده توکسین­ها را باز داشته یا آن را از بین می­برند یا ژن­هایی که مقاومت گیاه را افزایش می­­دهند. دسته بعدی ژن­هایی هستند که غلظت پپتید­های ضد­میکروبی را افزایش می­ دهند (Strange et al., 2005).
ژن­های جانوری که از آنها می توان برای ایجاد مقاومت در گیاهان استفاده کرد بسیار متنوع هستند که از حشرات، PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران و خزندگان قابل جداسازی هستند به عنوان نمونه سکروپین[۳] و دفنسین[۴] حشرات، برنینز[۵] قورباغه، ایندولوسیدین[۶] گاو نمونه­هایی از پروتئین­های ضد میکروبی هستند که ژن آنها قابل انتقال به گیاهان است (Li et al., 2012). از دیگر ژن­های با خواص ضدمیکروبی می توان به لاکتوفرین و لیزوزیم PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران اشاره کرد.

۲-۲- توتون “سیستم بیان گیاهی متداول”

توتون با نام علمی Nicotiana tabacum به عنوان یک سیستم بیان گیاهی مدل است که در سطح گسترده، جهت انتقال ژن­های مختلف بکار رفته است و بیشترین استفاده را در بین گونه­ های گیاهی به خود اختصاص داده است. از بهترین دلایل انتخاب آن، می توان به انعطاف­پذیری و آسانی نسبی دستورزی ژنتیکی، ایجاد عملکرد سالانه بیش از ۱۰۰ تن در هکتار و تولید بذر فراوان در گیاه اشاره کرد (Strange et al., ۲۰۰۵).
توتون یک محصول خودگرده افشان است و خویشاوندان زراعی یا وحشی کمی دارد. بنابراین امکان فرار ژن در این حالت بسیار کم است و بنابراین بر خلاف بسیاری از سیستم­های گیاهی، توتون مناسب­ترین شرایط را از نظر مسایل ایمنی زیستی و اخلاق زیستی دار است و کمترین احتمال آلودگی زنجیره­های گیاهی و جانوری را داراست )قاسم پور و همکاران، ۱۳۸۶).

۲-۳- معرفی پپتید های ضد میکروبی

پپتیدهای ضد میکروبی بوسیله­ موجودات مختلف تولید می­شوند که شامل باکتری­ ها حشرات، گیاهان و مهره داران می­باشند (Boulanger et al., 2006). همانطور که قبلا بحث شد چند روش برای گسترش تولید [۷]AMPدر سیستم­های میکروبی وجود دارد که از جمله­ آن به کنترل رونویسی و تولید پروتئین نوترکیب می­باشد، اما سیستم بیانی گیاهان به عنوان یک جایگزین مناسب برای تولید پپتیدها بدون نیاز به کنترل رونویسی، توانایی بیان در سطح بالا و فرایندهای پس از ترجمه گیاه می باشد مورد توجه قرار گرفته­اند (Haung et al., 2009). این پپتیدهای دارای شش سیستئن در توالی خود می­باشند که تشکیل سه باند دی­سولفیدی می­ دهند (Craik, 2011). این کمپلکس ساختار سه تایی از طریق پیش­سازش جداشده، خارج می­ شود و تا می­خورد که نتیجه­ آن تولید پپتید بالغ می­باشد. و پیشنهاد شده که پپتید اولیه به همراه یک آنزیم واکوئلی به نام آسپارزینیل اندوپپتیداز[۸] با دو فعالیت اندوپپتیدازی و تشکیل ساختار صحیح پروتئین این فرایند را انجام می­دهد (Craik et al., 1999).