صفات مورفولوژیکی ممکن است تحت کنترل چندین ژن باشند و از اینرو دارای نحوه توارث پیچیده­ای هستند.

نشانگرهای مولکولی

نشانگرهای مولکولی فراوان هستند و میتوان برای همه موجودات زنده از آنها استفاده کرد. اگرچه پتانسیل نشانگرهای مولکولی از ۷۵ سال پیش شناخته شده بود ولی کاربرد آنها تا حدود ۳۰ سال پیش بسیار محدود بوده است. چندین سیستم برای آشکارسازی نشانگرهای نشانگرهای مولکولی که قادر به شناسایی و برآورد تنوع موجود در توالی­های DNA ژنومی می­باشند، به منظور انجام مطالعات ژنتیکی ابداع و معرفی شده است. بررسی بسیاری از صفات با ارزش در گیاهان زراعی به دلیل پیشرفت­های حاصله در شناخت از سازماندهی ژنوم و ژنتیک گیاهی به کمک نشانگرهای مولکولی حاصل شده است. این نشانگرها در زمره پرکاربردترین نشانگرها هستند، زیرا به تعداد زیادی در ژنوم وجود دارند. این نوع نشانگرها در واقع از کلاس­های مختلفی از جهش­های ایجاد شده در DNA نظیر: جهش نقطه­ای، نوآرایی (حذف و اضافه شدن بازها) یا بروز اشتباهاتی در واحدهای تکراری DNA به وجود آمده­اند. از مزایای این نشانگرها خنثی بودن آنهاست، زیرا در مناطق خنثی ژنوم یا همان مناطق غیر رمز کننده واقع شده ­اند. برخلاف نشانگرهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی از نظر نوع و تعداد نامحدود هستند و تحت تاثیر عوامل محیطی و یا مراحل نموی گیاه قرار نمی­گیرند از جمله پرکاربردترین این نشانگرها در آنالیز پیوستگی ژنتیکی میتوان به RFLP، RAPD، SSR و AFLP اشاره نمود. کاربرد این روش­های فوق منجر به انقلاب جدیدی در اصلاح نباتات موسوم به گزینش به کمک نشانگر شده است. در تمام گونه­ های مهم زراعی، ژن­های بسیاری با بهره گرفتن از این روش شناسایی و جداسازی شده است. آنالیز لینکاژ ژنتیکی تبدیل به ابزار پرکاربردی در شناسایی و تعیین خصوصیات ژن­های کنترل کننده صفات چند ژنی مهم شده است. این نشانگرها به دو دسته نشانگرهای بیوشیمیایی و نشانگرهای مبتنی بر DNA تقسیم می­شوند.

شکل ‏۲‑۱۲ دسته­بندی نشانگرهای ژنتیکی [۸۱]

 

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

نشانگرهای پروتئینی یا بیوشیمیایی

نشانگرهای بیوشیمیایی به دو دسته تقسیم می­شوند: الف) ماکرو مولکول­ها ب) ایزوزایم­ها یا آلوزایم­ها برخی از تفاوت­های موجود در ردیف DNA بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین­هایی با اندازه­ های مختلف تجلی نمایند که از طرق مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و مطالعه می­گردند. این قبیل نشانگرها را نشانگرهای مولکولی در سطح پروتئین می­نامند که از آن جمله میتوان به سیستم آیزوزایم/آلوزایم اشاره نمود. در دهه ۱۹۵۰، نشانگرهای مولکولی قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئین­ها تحول شگرفی را ایجاد نمودند. ایزوزایم­ها بطور گسترده­ای در بررسی تنوع ژنتیکی و طبقه بندی گیاهان زراعی بکار گرفته شدند. تا اواخر دهه ۱۹۷۰ نقشه­های ژنتیکی تلفیقی از ایزوزایم­ها و نشانگرهای مورفولوژیکی بسیاری از گونه­ های مهم تهیه شدند. ایزوزایم­ها اشکال مختلف یک آنزیم با ماهیت پروتئینی هستند که واکنش یکسانی را کاتالیز می­نمایند یا در واقع میتوان گفت فرآورده ­های آلل­های مختلف یک یا چند ژن هستند. این نشانگرها را به راحتی میتوان با بهره گرفتن از ژل­های غیرخنثی از طریق واکنش رنگی یا سوبسترای مربوطه آشکار نمود. نشانگرهای پروتئینی (ایزوزایمی) نسبت به نشانگرهای مورفولوژیکی مناسب­تر هستند، زیرا این نشانگرها همبارز هستند و هر آنزیم محصول یگانه تنها یک ژن است و اختصاصی بودن ژن موردنظر را منعکس می­نماید. نشانگرهای پروتئینی نیز معایب مخصوص خود را دارا می­باشند. با توجه به اینکه روش­های رنگ آمیزی پروتئین­ها در مورد ایزوزایم­ها چندان زیاد نیست، تعداد ایزوزایم­های قابل ثبت و مشاهده که میتوان از آنها به عنوان نشانگر استفاده نمود به ۱۰۰ عدد هم نمی­رسد. از نکات منفی دیگر این نشانگرها محدودیت تنوع ژنتیک قابل ثبت در ایزوزایمهاست. به عبارت دیگر ایزوزایم­ها نه تنها کم هستند، بلکه چند شکلی و تفاوت قابل ثبت نیز در آنها چندان زیاد نیست. پیچیدگی فنوتیپ­های الکتروفورزی ایزوزایم­ها از دیگر معایب این قبیل نشانگرهاست. این پیچیدگی که به دلیل دخیل بودن آنزیم­ های مرکب از چند پلی پپتید مستقل در ترکیب برخی از ایزوزایم­ها می­باشد، امتیازبندی را دشوار می­ کند.

 

نشانگرهای DNA

برخی از تفاوت­های موجود در ردیف DNA بین دو دو موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند. نه صفت خاصی را کنترل می­ کنند و نه در ردیف اسیدهای آمینه پروتئین­ها اثری برجای می­گذارند. اینگونه تفاوتها فقط از طریق تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند و بنابراین به آنها نشانگرهای مولکولی در سطح DNA اطلاق می­گردند. نشانگرهای DNA به دو دسته کلی نشانگرهای مبتنی بر PCR و نشاتگرهای غیرمبتنی بر PCR تقسیم بندی ­می­شوند.

 

نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR

این دسته از نشانگرهای DNA بدون استفاده از روش PCR تولید و مورد استفاده قرار می­گیرند. سرگروه این دسته از نشانگرها، نشانگر تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم­ های محدودکننده می­باشد که RFLP نامیده می­ شود.
در اوایل دهه ۱۹۸۰ بوتستاین و همکارانش روش تفاوت طول قطعات قابل هضم یا RFLP را برای مطالعه مستقیم DNA و یافتن نشانگرهای ژنتیکی جدید پیشنهاد و معرفی نمودند. از میان نشانگرهای مولکولی مختلف ابداع شده، RFLP ها در زمره اولین نشانگرهای مولکولی بودند که در پروژه­ های مختلف ژنوم گیاهان و جانوران به کار رفته­اند. به همین دلیل به نشانگرهای مولکولی نسل اول هم موسوم می­باشند. RFLP ها در اثر تغییرات توالی DNA مانند اضافه شدن یا حذف شدن قطعات DNA، نوآرایی و جهش­های تک نوکلئوتیدی ایجاد می­شوند. این تغییرات سبب ایجاد، از دست رفتن یا جابجایی برخی جایگاه­­های برشی می­ شود که اساس ایجاد RFLP ها می­باشد. در این روش DNA ژنومی توسط آنزیم محدودگر خاصی هضم می­ شود و سپس بر روی ژل آگارز از هم جدا می­شوند. سیستم آللی یا جهش­های ژنتیک از تفاوت طول قطعات حاصل از هضم شناخته می­شوند. اگر دو نمونه گیاهی را در نظر داشته باشیم که فقط یک نوکلئوتید آنها در نقطه برش خاصی باهم متفاوت باشند، آنزیم محدودگر ویژه آن نقطه برش، DNA مستخرج از یکی از آن دو را برش خواهد داد و DNA نمونه دیگر در آن نقطه بدون برش باقی خواهد ماند. به این ترتیب قطعات حاصل از برش توسط آنزیم­ های محدودگر دارای طول متفاوت خواهد بود. اثبات شده است که این نشانگرها برای تعیین ژنوتیپ کارآمد و دقیق می­باشند. از محاسن این نشانگر میتوان تکرار پذیری بالا، فراوانی زیاد، همبارز بودن نام برد. همچنین این نشانگر تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صددرصد ژنتیکی است. از معایب این نشانگر میتوان به دشواری، پیچیدگی، نیاز به کاربرد مواد رادیواکتیو و نیاز به مقدار نسبتا زیادی DNA اشاره کرد.

 

نشانگرهای مبتنی بر PCR

واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای اولین بار در سال ۱۹۸۵ توسط سیکی و همکاران معرفی شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز که بطور اختصار PCR خوانده می­ شود روشی قوی می­باشد که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون برابر در مدت کمتر از نیمروز امکان پذیر می­ کند. اما از این روش زمانی میتوان استفاده کرد که حداقل ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه DNA موردنظر معلوم باشد. در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانندسازی DNA در طبیعت می­باشد، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه موردنظر DNA می­باشند، به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می­گیرند تا واکنش همانندسازی انجام گیرد. این همانندسازی یک فرایند آنزیمی بوده و توسط انواع مختلفی از آنزیم­ های پلیمراز صورت می­گیرد. نشانگرهای مبتنی بر PCR به دو دسته نشانگرهای اختصاصی و نشانگرهای غیر اختصاصی تقسیم بندی می­شوند [۸۲].
PCR یا واکنش زنجیره­ای پلیمراز:
فرایند PCR از سه مرحله مشخص تشکیل شده است. که این مراحل به وسیله تغییر در درجه حرارت، هر مرحله تعیین می­ شود. در مرحله اول DNA دورشته­ای واسرشته شده و دو رشته از هم جدا می­شوند. در مرحله دوم درجه حرارت پایین می ­آید تا حدی که اتصال آغازگر به الگو را امکان پذیر سازد. در حین مرحله اتصال آغازگر به الگو آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت فعال می­ شود و شروع به بسط آغازگرها می­ کند. در مرحله سوم درجه حرارت دوباره افزایش می­یابد تا اینکه به یک حد مناسب جهت فعالیت پلیمرازی آنزیم DNA پلیمراز برسد. اگر PCR با کارایی ۱۰۰درصد انجام گیرد، در طی ۲۰ چرخه یک میلیون نسخه از DNA موردنظر تولید می­ شود.

 

نشانگرهای غیر اختصاصی

 

RAPD

این روش در سال ۱۹۹۰ توسط دو گروه ویلیامز و همکاران و ولش و مکلند ارائه شد. در این روش از آغازگرهایی به طول ۸ تا ۱۰ نوکلئوتید که ردیف بازی آن بطور قراردادی تعیین می­ شود، استفاده می­گردد. در این واکنش یک آغازگر منفرد نقاط ممکن خود را روی دو رشته متقابل DNA ژنومی نمونه­ها یافته و در آن نقاط بر روی دو رشته مکمل DNA متصل می­ شود. اگر محل اتصال آغازگرها در روی دو رشته متقابل بهم نزدیک باشند، ردیف بین آن دو نقطه اتصال طی واکنش PCR تکثیر خواهد شد. پلیمورفیسم در RAPD به شکل حضور و غیاب یک باند مشخص می­ شود. نشانگرهای RAPD از نوع غالب هستند. از مزایای این روش امکان بررسی همزمان چندین جایگاه در ژنوم نمونه­ها و عدم نیاز به مواد رادیواکتیو می­باشد. از معایب این روش میتوان به تکرارپذیری کم، غالبیت و عدم امکان تشخیص سیستم آللی اشاره کرد. از این روش جهت شناسایی ارقام و رده­بندی درون گونه­ای و بین گونه­ای در گیاهان مختلف استفاده کرد. نشانگر RAPD در روش تجزیه توده­ای افراد درحال تفرق بهترین گزینه است.

 

نشانگرهای اختصاصی

 

AFLP

با روش AFLP نشانگرهایی تولید شد که علاوه بر دارا بودن مزایای RFLP مانند دقت و تکرارپذیری، دارای ویژگی­های مثبت روش­های مبتنی بر PCR نیز می­باشند (وس و همکاران ۱۹۹۵). این روش براساس تکثیر انتخابی برخی قطعات از بین تمام قطعات هضم شده DNA می­باشند. این روش شامل سه مرحله مجزا می­باشد. در مرحله اول DNA موردنظر را با یک آنزیم محدودگر هضم کرده و سپس اتصال آنها به آداپتور ایگونوکلئوتیدی.در روش AFLP استاندارد معمولاً از ترکیب آنزیمی MseI / EcoRI در واکنش هضم استفاده می‌گردد. در مرحله دوم طراحی و ساخت آغازگر و همچنین تکثیر انتخابی دسته­ای از قطعات حاصل از هضم انجام می­ شود. در مرحله سوم جداسازی قطعات حاصل از تکثیر بر روی ژل­های پلی آکریل آمید و سپس رنگ­آمیزی با نیترات نقره برای ثبت نتایج انجام می­ شود. هریک از قطعاتی که به صورت باند بر روی ژل ظاهر می­ شود می­توانند به عنوان یک نشانگر ژنتیک مورد استفاده قرار بگیرد. در این روش در مقایسه با سایر روش­ها بیشترین تعداد نشانگر به ازای هر ژل به دست می­آید. همچنین دقت و تکرارپذیری این روش بسیار بالا است ولی از معایب عمده این روش میتوان به غالب بودن این نشانگر و عدم امکان تشخیص آلل­های هر نشانگر اشاره کرد[۸۲].

 

SSR

SSR یکی از مهمترین گروه­های نشانگرهای مولکولی می­باشد. این روش مبتنی بر PCR می­باشد و در انگشت نگاری DNA، نقشه یابی ژنتیکی، MAS و مطالعه تنوع ژنتیکی و ژنتیک جمعیت استفاده می­ شود. این دسته از نشانگرها در موجودات پیشرفته تر مثل هسته داران دیده می­ شود. این گروه از نشانگرها مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلیمراز هستند که دارای موتیف تکرار شونده به طول یک تا شش جفت باز می­باشند و می­توانند تا حدود ۱۰۰ برابر تکرار شوند. این توالی­ها عمدتا در مناطق بین ژنی و مناطق غیر رمز کننده در سراسر ژنوم توزیع شده ­اند. نشانگرهای میکروساتلایتی فراوان، پلیمورفیسم زیاد و همبارز هستند. در این نشانگر، فرآورده ­های PCR را میتوان با بهره گرفتن از ژل آگارز، ژل پلی آکریل آمید غیر واسرشته کننده و ژل پلی آکریل آمید واسرشته کننده آشکار نمود. از سیستم ژل آگارز با بهره گرفتن از غلظت بالای ۲ درصد و سپس رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید معمولا در برنامه MAS استفاده می­ کنند. ولی در بقیه موارد از ژل پلی آکریل آمید و از الکتروفورز عمودی استفاده می­ کنند. ردیف های تکرار شونده بر اساس اندازه واحد تکرار به چهار گروه تقسیم می­شوند [۸۲].

 

 

DNA ماهواره ای:

در ماهواره ها ردیف های تکرار شونده از چند جفت باز تا چند صد جفت باز تکرار می­شوند. ماهواره ها معمولا در نواحی هتروکروماتین قرار دارند. ماهواره ها معمولا رونوشت برداری نمی­شوند و فعالیت خاصی ندارند، ولی تصور می­ شود که در جفت شدن، تفرق یا نوترکیبی کروموزوم ها نقش دارند. محققین از ماهواره ها برای نقشه یابی ژنوم انسان به عنوان نشانگرهایی که با سانترومر ارتباط دارند استفاده می­ کنند.

 

 

ماهوارک ها:

ماهوارک ها واحدهای ۱۰ تا ۶۰ جفت بازی هستند که ممکن است صدها بار تکرار شده باشند. ماهوارک ها بیشتر در نواحی یوکروماتین ژنوم PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران، قارچ ها و گیاهان قرار دارند. از ماهوارک ها در انگشت نگاری DNA انسان استفاده می­ کنند.

 

 

میان ماهواره­ها:

این اصطلاح، برای بیان دسته­ای از DNA­های تکراری که ویژگی­های ماهوارک­ها و ریزماهواره­ها را دارند و طول آنها در جایگاه مربوطه در حدود ۴۰ جفت باز می­باشد.

 

 

ریز ماهواره ها:

شامل واحدهای تکی، دوتایی، سه تایی، چهارتایی، پنج تایی، یا شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم یوکاریوت ها پراکنده هستند.
مزیت­های SSR به شرح زیر می­باشد:

 

 

این تکنیک بسیار ساده بوده و استفاده از آن آسان است.

آزمایش مبتنی بر PCR است. برای مشاهده­ نتایج کافی است که فقط محصولات تکثیر را توسط الکتروفورز تکثیر نمود. بدین ترتیب زمان مورد نیاز برای دست­یابی به نتایجی قابل قیاس با روش­های مبتنی بر هیبریداسیون، به طور قابل ملاحظه­ای کاهش می­یابد.

می­توان از به کارگیری رادیوایزوتوپ­ها اجتناب ورزید زیرا که اندازه­ چند شکلی بین آلل­ها برای مشاهده در ژل­های آگارز به قدر کافی بزرگ است.

ریزماهواره­ها به صورت نشانگرهای هم­بارز تفرق می­یابند.

چند شکلی ایجاد شده قابل اعتماد است.

معایب SSR نیز به شرح زیر می­باشد:
نشانگرهای SSR دارای محدودیت­هایی هستند که بر کاربرد عمومی آنها به عنوان نشانگرهای مولکولی مؤثر است. از جمله این محدودیت­ها می­توان به صرف وقت و هزینه­ زیاد در طراحی و ساخت آغازگرها، چند شکلی بیشتر از حد واقعی، دانش اندک در مورد نحوه­ جهش و روش­های برآورد و تجزیه و تحلیل داده ­ها اشاره نمود. علاوه بر آن، نمی­توان نقش­های حاصل از آن را به یک جایگاه ژن نسبت داد. همچنین عیب دیگر آن این است که به بررسی تنوع بین افراد در قسمتی از ژنوم می ­پردازد که به احتمال زیاد فاقد ژن است [۸۲].

 

RFLP-PCR

آنالیز RFLP پرزحمت و وقتگیر است همچنین تکنیک RFLP نیاز به مقدار زیادی DNA دارد. به همین دلیل در تکنیک RFLP تغییراتی داده شده است تا امکان استفاده به راحتی برای تعداد زیادی نمونه انجام شود. در گذشته از تکنیک وقتگیر لکه گذاری سادرن استفاده می­کردند. ولی امروزه محققین از روش PCR-RFLPجهت آشکارسازی استفاده می­ کنند. این روش نیاز به مقدار بسیار کمتری DNA دارد و قابل کاربرد برای آنالیزهای سریع می­باشد و با بهره گرفتن از آنها میتوان برای تعداد زیادی نمونه تعیین ژنوتیپ کرد. این روش بطور وسیعی برای آشکارسازی سریع و مطمئن تنوع موجود در توالی DNA استفاده می­ شود. همچنین این روش موجب افزایش نمایان سازی پلیمورفیسم موجود بین نمونه­های مختلف می­گردد. نشانگرهای ایجاد شده به وسیله PCR-RFLP را CAPS می­نامند و اثبات شده است که جهت نقشه­یابی مکان­های ژنی جهش یافته و ژنوتیپ­یابی SNP که کم هزینه و قابل کاربرد با تعداد متوسط نمونه می­باشد. وجود این تنوع به تولید جایگاه­های برشی منجر می­ شود که تفاوت یک جفت آلل را در فرایند سه مرحله­ ای زیر آشکار می­سازد: در مرحله اول تکثیر توالی DNA مورد نظر از طریق PCR. در مرحله دوم هضم با بهره گرفتن از آنزیم­ های برشی و سپس در مرحله سوم آنالیز قطعات حاصله به وسیله الکتروفورز.

 

RFLP Based PCR با اتصال ناقص

در روش CAPS یک محدودیت وجود دارد و آن این است که فقط جهش­های ایجاد کننده یا حذف کننده جایگاه شناسایی آنزیم برشی را میتوان تشخیص داد. همه تغییراتی که در تک نوکلئوتیدها ایجاد می­ شود، منجر به ایجاد جایگاه برشی نمی­شوند. به همین منظور برای آشکارسازی این تغییرات، روشی شبیه به CAPS به نام dCAPS ابداع شده است که در آن واکنش PCR را با آغازگرهایی انجام می­ دهند که یک یا چند نوکلئوتید برای ایجاد اتصال ناقص در آنها وجود دارد. در این روش آلل­هایی را که به واسطه تغییرات تک نوکلئوتیدی باهم تفاوت دارند، میتوان از یکدیگر تشخیص داد. گیاهان هتروزیگوت را میتوان با بهره گرفتن از این روش به دلیل همبارز بودن نشانگر به سرعت شناسایی نمود [۸۲].

 

فصل سوم
مواد، تجهیزات و روش تحقیق

مواد مورد استفاده مورد استفاده در این پایان نامه در جدول شماره۳-۱ آورده شده است.
جدول ‏۳‑۱ مواد مورد استفاده در پایان نامه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

حق انحصاری © 2021 مطالب علمی گلچین شده. کلیه حقوق مح