کیت استخراجDNA

دنا زیست

کیت استخراج ژل

یکتا تجهیز آزما

دستگاه­های مورد استفاده در این تحقیق به صورت زیر می­باشد:
انکوباتور شیکردار مدل INFORS FG, Eittergasse 27 , CH-4103 Bottmingen
دستگاه انکوباتور مدل Memmert
هود لامینار مدل BEASAT-BSC126
دستگاه اسپکتوفوتومتر مدل Varian cary 50 UV- visible
آون Binder
ترازوهای معمولی و دیجیتال مدل Mehlern Toledo
بن­ماری Memmert
ورتکس
اسپین
هیتر Heidolph, (Heater stirrer)
الکتروفورز
PCR ترموسایکلر مدل Hielscher
Gel doc مدل Cyngene
PH متر
سانتریفیوژ مدل NAPCO-2028R
وسایل دیگر آزمایشگاهی که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند شامل موارد زیر می باشند:
میکروتیوپ، فالکون، سمپلر، سر سمپلر،پتری دیش، ارلن، بشر، استوانه مدرج، لوله آزمایش، شیشه­های درب آبی، قاشقک، لوپ،مگنت

استخراج کوتین

در اولین مرحله شناسایی گونه­ های تولید­کننده آنزیم کوتیناز، نیاز به تهیه سوبسترای کوتین می­باشد. با توجه به عدم در دسترس بودن کوتین در بازار لازم بود که آن را از میوه­ ها تهیه کنیم. به این منظور میوه­ های سیب قرمز، سیب زرد، گوجه­ فرنگی و خیارسبز از سوپرمارکت خریداری شدند. میوه­ ها شست­و­شو داده و وزن گردیدند آنگاه پوست میوه­ ها را جدا کرده و بعد از وزن کردن پوست میوه­ ها، آنها را در بافر اگزالات (۲گرم اگزالیک اسید، ۸گرم آمونیوم اگزالات، ۵۰۰ میلی لیتر آب) به مدت ۴ ساعت جوشانده شد تا پالپ­ها کاملا جدا شوند پوست­ میوه­ ها را فیلترکرده و با آب مقطر شست­و­شو داده و وزن کرده و سپس پوست­ها را در آون ۴۰ درجه سانتیگراد خشک کرده و آسیاب می­کنیم. پودر بدست آمده را در محلول کلرفرم متانول به نسبت۲ به ۱ (۶۰ میلی­لیترکلروفرم، ۳۰ میلی­لیتر متانول) می­ریزیم و به مدت ۱۲ تا ۲۴ ساعت روی شیکر قرار می­دهیم و سپس به محلول بدست­آمده آب اضافه کرده و در دستگاه سانتریفیوژ با دور ۱۲۰۰۰ و به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شدند سه فاز در این حالت تشکیل می­ شود که فازهای رویی را دور ریخته سپس فاز زیری را جدا می­کنیم. فاز زیری را درون پتری ریخته و پتری را در آون ۸۰ درجه سانتیگراد خشک می­کنیم. پودر بدست آمده همان کوتین است [۵۶].

نمونه برداری

نمونه­های قارچی و باکتریایی از پوست میوه و خاک باغچه (مرطوب و از برگ­های در حال تجزیه) نمونه معمولی خاک سطح برگ یا میوه­ های مشکوک به آلودگی توده­ی باکتری ، ورمی­کمپوست جمع­آوری شد.

غربالگری و جداسازی گونه­ های تولیدکننده آنزیم کوتیناز

به منظور غربالگری و جداسازی سریع نمونه­های تولید کننده آنزیم کوتیناز از محیط کشتی باید استفاده گردد که کوتین تنها منبع کربن آن برای استفاده میکروارگانیزم­ها باشد و تنها میکروارگانیزم­هایی در این محیط رشد کنند که قادر به تجزیه کوتین باشند.
این محیط کشت حاوی ترکیبات زیر است:
۰۳/۰ گرم سدیم­کلرید، ۰۳/۰ گرم آهن­نیترات، ۰۳/۰گرم پتاسیم­کلرید، ۵/۰ گرم آمونیوم­کلرید، ۰۱/۰ گرم آهن­سولفات، ۰۶/۰ گرم پتاسیم­دی­هیدروژن فسفات، ۰۲/۰ گرم منیزیم­سولفات. این مواد را در ۱۰۰ میلی لیترآب حل کرده سپس pH محیط را به ۲/۷ رسانده و به آن ۴/۰ گرم کوتین اضافه کرده و اتوکلاو شد[۵۷].
بدین منظور در ۹ فالکون در هر کدام ۱۰ میلی لیتر از محیط کشت تهیه شده در مرحله قبل ریخته و به صورت زیر کشت می­دهیم. در یکی از محیط کشت­ها چیزی کشت ندادیم و به عنوان نمونه شاهد قرار دادیم، در محیط کشت شماره یک ۱/۰ گرم از خاک باغچه ریختیم، درمحیط کشت شماره دو ۱/۰گرم خاک کمپوست، در محیط کشت شماره سه ۱/۰ گرم خاک باغچه ( پای درخت توت)، در محیط کشت شماره چهار ۱۸/۰ گرم از ناحیه­ی آلوده پوست سیب قرمز، درمحیط کشت شماره پنج ۳۵/۰گرم از ناحیه­ی آلوده­ی پوست سیب­زرد، در محیط کشت شماره شش هم۶۴/۰گرم پوست گوجه آلوده، در محیط کشت هفت ۵۹/۰ گرم از پوست آلوده به میکروب سیب زرد و درمحیط کشت شماره هشت ۱۴/۰گرم از پوست آلوده­ی سیب زرد کشت دادیم. سپس نمونه­ها به مدت ۳ تا ۵ روز در شیکرانکوباتور با دمای ۳۰ درجه وrpm 150 قرار داده شد [۸۳].
بعد از رشد کردن اولیه نمونه­ها نیاز به غربالگری آنها در روی محیط کشت جامد می­باشد. محیط کشت جامد حاوی ترکیبات زیر است:
۰۳/۰ گرم سدیم­کلرید، ۰۳/۰ گرم آهن­نیترات، ۰۳/۰ گرم پتاسیم­کلرید، ۵/۰ گرم آمونیوم­کلرید، ۰۱/۰ گرم آهن­سولفات، ۰۶/۰ گرم پتاسیم­دی­هیدروژن­فسفات، ۰۲/۰گرم منیزیم­سولفات و ۵/۳ گرم آگار را در ۱۰۰ میلی لیترآب حل کردیم. سپس pH محیط به ۲/۷ رسانده شد، به آن ۴/۰ گرم کوتین اضافه کردیم و محیط حاصل اتوکلاو گردید و بین پلیت ها تقسیم گردید. ۲۰میکرولیتر از هر محیط کشت مایع را در زیر هود در هر پلیت تلقیح کرده و بعد به انکوباتور ۳۰ درجه منتقل گردیده شد.
به دلیل اینکه نمونه­های کشت داده شده و رشد کرده خالص نبودند، برای تخلیص نمونه­ها، کلنی­های رشد کرده به پتری­های دیگر حاوی محیط کشت انتقال دادیم. بعد از رشد مناسب سویه­ها، پلیت­های موردنظر تا زمان ساخت اسلنت در یخچال ۴ درجه نگهداری می شود. سپس هر سویه را به یک slant برای نگهداری به یک محیط کشت مایع برای سنجش فعالیت کوتیناز انتقال دادیم. بعد از رشد نمونه­ها یک تک کلنی را برداشته و در محیط کشت مایع درون فالکون تلقیح داده شد و به مدت ۳ تا ۴ روز درون انکوباتور شیکردار با دور ۱۵۰ دور در دقیقه و دمای ۳۰ درجه سانتیگراد تیمار گردید. ۴ گرم نوترینت اگار را در ۲۰۰ میلی لیتر اب حل می­کنیم اتوکلاو می­کنیم سپس بین پتری­ها تقسیم می­کنیم و سپس باکتری­ ها را انتقال می­دهیم. از این پتری­ها نمونه­ها را به اسلند انتقال می­دهیم.

تهیه slant از سویه­های جدا شده

یک کلنی خاص از سویه­های جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنت­ها به مدت ۴۸ ساعت، آنها در یخچال و دمای ۴ درجه نگهداری می­شوند. اسلنت­ها را هم به مدت ۴۸ ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. ۱۵۰ میلی­لیتر آب را و ۳ گرم نوترینت اگار را در بشر با حرارت ملایم حل می­کنیم و در هر لوله ۱۵ میلی­لیتر می­ریزیم بعد پنبه می­گذاریم و اتوکلاو می­کنیم بعد به صورت کج می­گذاریم تا ببندد و بعد از بستن و سرد شدن و یک کلنی خاص از سویه­های جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنت­ها به مدت ۴۸ ساعت، آنها در یخچال و دمای ۴ درجه نگهداری می­شوند. Slant ها را هم به مدت ۴۸ ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. (slant به مدت یک ماه قابل نگهداری است).

نگهداری طولانی مدت سویه­ها

به منظور نگهداری طولانی مدت سویه­ها، ابتدا محیط کشت مایع نوترینت براس یا LB تهیه نموده و سویه­ها را در آن تلقیح کرده و در شیکر انکوباتور به مدت ۲۴ ساعت به منظور رشد بهینه قرار داده می­ شود سپس ۷۶۰ میکرولیتر از محیط کشت حاوی باکتری و ۷۶۰ میکرولیتراز گلیسرول ۴۰% به میکروتیوب­های ۵/۱ میلی لیتری انتقال داده و به مدت چند دقیقه به آرامی تکان داده می­ شود و در فریزر۸۰- برای طولانی مدت نگهداری می­ شود.

تهیه گلیسرول

۲۰۰ میکرولیتر گلیسرول و ۸۰۰ میکرولیتر آب مقطر را بهم افزوده و گلیسرول ۲۰% تهیه می شود.

تهیه محیط کشتLB

۵ گرم y(مخمر)
۱۰ گرم T(تریپتون)
۵ گرم nacl
این سه ماده را به هم اضافه نموده و آب مقطر به حجم یک لیتر اضافه می­ شود و اتوکلاو می­ شود.
محیط کشت LB را بعد از اتوکلاو در هر فالکون ۵ میلی­لیتر می­ریزیم و نمونه را به آن انتقال می­دهیم. سپس به مدت ۱۲ تا ۲۴ ساعت در انکوباتور می­گذاریم. بعد فالکون­های حاوی محیط کشت LB و نمونه را با rpm 4000 و به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ می­کنیم.