۱/۰

MgCl2

۶/۰

آب مقطر

۳/۵

حجم نهایی

۱۰

۲-۹ آزمون کارآیی پرایمرهای طراحی شده برای نشان دادن تنوع تک نوکلئوتیدی

برای آزمون قابلیت پرایمرهای طراحی شده برای نشان دادن پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) در ژن های مورد مطالعه، قطعات ژنی مورد نظر در تعداد محدودی ژنوتیپ­ (۴ ژنوتیپ) تکثیر شده و سپس وجود تنوع تک نوکلئوتیدی در این قطعات از طریق توالی­یابی مورد بررسی قرار گرفت. برای اطمینان کامل از نتایج توالی­یابی، هر دو پرایمر فوروارد و ریورس در واکنش­های جداگانه برای تکثیر یک قطعه مورد نظر و سپس توالی یابی آن قطعه استفاده شدند. در نهایت، نتایج این توالی ها با توالی اصلی ژن که در GeneBank گزارش شده (توالی هایی که پرایمرها از روی آنها طراحی شدند)، مقایسه گردیدند. توالی یابی به کمک دستگاه ABI 3100 انجام گرفته است. قطعات ژنی تکثیر شده توسط پرایمرها، روی ژل آگارز ۲/۱ درصد تست گردیدند. شکل ۲-۱۰ محصول PCR چهار ژنوتیپ که هر یک با ۵ پرایمر روی ژل آگارز مورد آزمایش قرار گرفته­اند را نشان می­دهد.
پرایمر ۱
M
پرایمر۲
پرایمر۳
۲۲۶ /۲۱ جفت باز
۱۴۸/۵ جفت باز
۰۲۷/۲ جفت
۵۶۴جفت باز
پرایمر ۵
پرایمر۴
۲۲۶ /۲۱ جفت باز
۱۴۸/۵ جفت باز
۰۲۷/۲ جفت باز
۵۶۴ جفت باز
شکل ۲-۱۰ محصول PCR پنج پرایمر که هر یک در چهار ژنوتیپ تست شدند، روی ژل آگارز ۲/۱ %
۲-۱۰ واکنش توالی­یابی
برای انجام توالی­یابی، محصولات PCR با کیفیت بسیار بالا و فاقد قطعات غیر اختصاصی ژن مورد نظر نیاز می­باشد. این واکنش شامل مراحل زیر بوده است:
در مرحله اول، واکنش PCR برای نمونه­های گیاهی انجام گرفته و محصولات حاصل روی ژل آگارز تست شدند. بعد از اطمینان از تکثیر قطعات ژنومی مورد نظر و فقدان هر گونه باند اضافی روی ژل، این محصولات برای مرحله بعدی آماده شدند.
در مرحله دوم، برای هر محصول PCR که در مرحله قبل تهیه شده بود دو واکنش زنجیره­ای پلیمراز انجام گرفت. یک واکنش PCR با پرایمر فوروارد و دیگری با پرایمر ریورس. زیرا در این مرحله هدف از انجام این واکنش تولید تعداد زیادی محصول PCR تک رشته­ای است. مواد مورد نیاز برای این واکنش PCR در جدول ۲-۳ آمده است. شرایط PCR در این مرحله شامل یک چرخه دمائی ۹۶ درجه سانتی ­گراد به مدت یک دقیقه، سپس ۲۵ چرخه دمایی شامل دمای ۹۶ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۰ ثانیه، دمای ۵۰ درجه سانتی ­گراد به مدت ۵ ثانیه و دمای ۶۰ درجه سانتی ­گراد به مدت ۴ دقیقه و یک چرخه انتهائی با دمای ۴ درجه سانتی ­گراد بوده است.
مرحله سوم خالص سازی محصولات PCR است. مراحل خالص سازی به شرح زیر می­باشد.
ابتدا ۱۰ میکرولیتر محصول PCR با ۴۰ میکرولیتر آب مقطر، ۱۵۰ میکرولیتر الکل مطلق و ۵ میکرولیتر استات سدیم ۳ مولار مخلوط شده و به مدت ۶-۵ دقیقه تکان داده شده، سپس به مدت ۱۵ دقیقه در فریزر قرار داده شدند. پس از آن، به مدت ۱۵ دقیقه در سانتریفیوژ با دور ۸۰۰۰ دور در دقیقه قرار گرفتند. بعد از آن، محلول موجود در داخل تیوب­ها خارج شده و تیوب­ها به حالت معکوس روی یک سطح تمیز قرار داده شدند تا کاملاً خشک شوند. سپس ۲۰۰- ۱۵۰ میکرولیتر الکل ۷۵% به هر تیوب اضافه گردید تا شستشو انجام گیرد. تیوب­ها برای مدت کوتاهی با دست تکان داده شده و مجدداً به مدت ۱۰ دقیق در سانتریفیوژ ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه قرار داده شدند. پس از آن، محلول موجود در تیوب­ها خارج شده و در دستگاه خشک کن قرار داده شدند. پس از خشک شدن کامل تیوب­ها، به هر یک از آن­ها ۵/۶ میکرولیتر فرمامید به عنوان بافر اضافه گردید و تیوب­ ­ها با دور ۶۰۰-۵۰۰ دور اسپین شدند تا رسوب موجود در ته ظرف با بافر کاملاً مخلوط گردد.
در مرحله چهارم محصولات PCR خالص سازی شده برای دِنیچره شدن به مدت ۵-۴ دقیقه در دستگاه ترموسایکلر با دمای ۹۴ درجه سانتی ­گراد قرار داده شده و بلافاصله پس از خارج کردن از دستگاه روی یخ قرار گرفتند تا از رِنیچره شدن آن­ها جلوگیری شود.
در مرحله آخر، محصولات PCR دِنیچره شده برای توالی­یابی در دستگاه ABI3100 (شکل ۲- ۱۱) قرار داده شدند. شکل ۲- ۱۲ نمونه ­ای از کروماتوگرام نمونه­های توالی یابی شده در دستگاه AB3100 را نشان می­دهد.
جدول ۲-۳ مواد مورد نیاز برای انجام دومین واکنش PCR در توالی­یابی

مواد مورد نیاز

میزان مواد مورد نیاز (میکرولیتر)

کیت^* توالی­یابی