Lamare et al.,1995, 1997

Biphasic medium
Organic media
Gas/solid system

Lyophilized preparation
Solution
Suspensin
Solid form

کوتیناز لیوفیلیزه برای تعیین مکانیسم واکنش stereoselectivity استفاده شده است، کوتیناز لیوفیلیزه همچنین به یک سیستم دوفازی آبی- ترئولین اضافه شد که این تری­گلیسیرید را به اسید اولئیک و گلیسرول هیدرولیز می­ کند [۵۹]. کوتیناز بر روی بسترهای جامد بصورت جذبی یا اتصال کوولانت تثبیت شده و در هیدرولیز­های مختلف[۶۰-۶۲]، استریفیکاسیون [۶۳] و واکنش تبادل استری [۶۴-۶۶] استفاده می­ شود. بیشتر مطالعات جذبی کوتیناز بر روی Accurel EP 100، یک بستر macroporous polypropylene انجام شده است [۶۳]. این بستری مناسب برای تثبیت کوتیناز است که منجر به اماده سازی انزیم فعال و با ثبات می­ شود.
اتصال کوولانسی کوتیناز بر روی تکیه­گاه سلیکا و مشتقات سلیسی مورد بررسی قرار­گرفته­است. هرچند نتایج نشان می­دهد بازده جفت­شدگی (۶ تا ۲۶%) و پایداری دمایی آن بسیار پایین است. این نتایج بیان می­ کند که جفت­شدگی کوولانت به نظر نمی­رسد که یک روش کافی برای تثبیت کوتیناز باشد.
از زئولیت­ها به طور موفقیت آمیزی به عنوان بستر مناسب برای جذب کوتیناز در یک مجموعه ­ای از آزمایشات استفاده شده است [۶۷].
زئولیت­ها سلیکولومینت­های بلوری هستند که دارای ساختار بسیار دقیق میکروپوروس بوده که برخی از ویژگی ها­ی عمومی شناخته شده مسئول در کاربردهای گسترده انها در تجزیه، جذب و تبادل یونی را نشان می­دهد [۶۸]. این خصوصیات با امکان تولید و تنظیم اسید-باز و خصوصیت ابگریز_ابدوست و تمایل زیاد به جذب انتخابی مرتبط است. بنابراین سطح خارجی کریستالی زئولیت ،ویژگی­های جالبی برای جذب آنزیم ارائه می­دهد که می تواند به عنوان یک رابط فاز ابی در داخل زئولیت و محیط آلی حاوی سوبستراها استفاده می­ شود. کوتیناز با موفقیت بر روی زئولیت های مختلف با بازده بالای کوپلینگ (۶۰ تا ۸۰%) و فعالیت خاص ، برای مثال روی زئولیت NAY (9 U/mg enzyme) تثبیت شده است. در کوتیناز تثبیت شده پایداری دمایی بالا نشان داده شده(۴۵ روز ۳۰ درجه سانتیگراد بدون از دست دادن فعالیت) که بسیار بالاتر از پایداری دمایی گزارش شده بر روی بسترهای دیگر است [۶۰].
کوتیناز به دام افتاده در کپسول­هایی از ماتریکس ژل یک روش نامناسب برای تثبیت کوتیناز می­باشد. به دلیل ویژگی آب دوست بسیاربالای آلژینات، تفکیک و پخش هر دو اثر باز دارنده روی عمل کاتالیزوری کوتیناز دارد که این عمل برای دیگر لیپازها در سوبستراهای چربی دوست رخ می­هد [۶۰].
یکی دیگر از روش­هایی که از کوتیناز استفاده می­ کند تثبیت کوتیناز در میکروکپسول­هایی از میسل معکوس ار سورفاکتانت در محیط­های الی است که با موفقیت برای هیدرولیز [۶۹]، استریفیکاسیون [۷۰, ۷۱] و تبادل استری [۷۲] استفاده می­ شود. میسل معکوس یک سیستم مناسب برای توسعه biocatalysis در محیط­های آلی است. محلول کردن آنزیم­ها در حفره­ی آب از میسل معکوس موجب حفظ فعالیت کاتالیستی آنزیم در برابر اثر منفی حلال بر ساختار آن می گردد. علاوه براین encapsulation در میسل معکوس یک ناحیه بین سطحی فراهم می­ کند و امکان ایجاد حلالیت سوبستراهای آبگریز و آبدوست را فراهم کرده و اغلب فعالیت انزیم را افزایش می­دهد. جدایی محصولات و بهبود عمل انزیم امکان­ پذیر شده و زمینه تحقیق در خصوص استفاده از میسل ایجاد می­ شود. یکی از پارامترهای مهم برای فعالیت بهینه آنزیم در میسل معکوس نسبت مولی اب به سورفاکتانت است که اغلب ω۰ گفته می­ شود. حداکثر تمایز در فعالیت آنزیمی معمولا زمانی که ۰ω ارزش دارد یافت می­ شود. اندازه میسل معکوس به این پارامتر بستگی دارد. وقتی که ارزش ۰ω کم می شود میسل ها ممکن است بیش از اندازه برای جا دادن مولکول­های آنزیم کوچک شوند، در مقادیر بالا مقدار زیادی آب موجود است که ممکن است با واکنش آنزیمی تداخل نماید.
انتخاب شرایط قابل استفاده نباید منحصرا بر اساس این معیارها باشد، چون بهترین معیار برای تثبیت ممکن است با انهایی که برای فعالیت بیشتر مورد بحث قرار می­گیرد منطبق نباشد. در محیط آلی ممکن است تغییر تعادل واکنش به سمت سنتز باشد. به وسیله­ کنترل صحیح مقدارآب یک واکنش هیدرولیزی از استر می ­تواند منجر به تولید یک الکل و اسید شود که می ­تواند استریفیکاسیون معکوس را انجام دهد. همچنین واکنش تبادل استری و اینتراستریفیکاسیون می ­تواند در کم ابی انجام گیرد.
کنترل شرایط واکنش و نیز تبدیل سوبسترا با بهره گرفتن از روش های دقیق­تر بهبود یافته است.یک مثال خوب از روش nuclear magnetic resonance) NMR) برای نظارت انلاین روی واکنش کاتالیز لیپاز در حلال­های الی بدون نیاز به نمونه در محیط واکنش توسعه یافته است.

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

عملکرد کوتیناز در واکنش­های هیدرولیزی و سنتزی

هیدرولیز

هیدرولیز تری­گلیسیرید­ها و انالوگ­ها به وسیله­ کوتیناز در چندین سیستم واکنش برای مثال در میسل معکوسAOT و سیستم های دو فازی مورد مطالعه قرار گرفته است. در سیستم دو فازی تبدیل triolein با بهره گرفتن از یک سیستم تک لایه دنبال شد [۵۸]. آنالیز کینتیک هیدرولیز تری­گلیسریدهای مختلف، تری­کاپریلین، تریلورین و تری­مریستین tricaprylin, trilaurin and) trimyristin) نیز انجام گرفته است [۶۹]. کوتیناز فعالیت بیشتر و اختصاصی را برای زنجیره کوتاه­تری گلیسیرید مورد مطالعه نشان می­دهد. این نتایج مطابق با دیگر یافته­ ها درباره انتخابی بودن و اختصاصیت کوتیناز است.
هیدرولیز تری کاپریلین به وسیله­ کوتیناز جذب شده بر روی زئولیت NAY ، اتصال کوولانت آن بر روی سلیکای متخلخل و محبوس کردن آن در آلژینات کلسیم نیز مورد مطالعه قرار گرفته است [۶۰]. مقدار pH در حدود ۸ برای هر سه کوتیناز تنظیم شد و بیشترین فعالیت اختصاصی با جذب کوتیناز روی زئولیت بدست آمد (جدول۲-۵).

استریفیکاسیون

سنتز استر اسیدهای چرب به وسیله­ کوتیناز در میسل معکوس از هر دوسورفاکتانت های AOT انیونی [۷۳] و CTAB کاتیونی [۷۰] مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته است. استریفیکاسیون اولئیک اسید با الکل های الیفاتیک به وسیله کوتیناز محصور شده در میکرو کپسولهای میسل معکوس AOT نشان داد که کوتیناز دارای اولویت برای C5 به الکل های C6 است [۷۳]. اثر طول زنجیره اسیدچرب در استریفیکاسیون هگزانول نیز مورد بررسی قرار گرفت و حداکثر فعالیت با بوتریک اسید بدست امد، بعضی واکنش ها نیز با کوتیناز محصور شده در میسل معکوس CTAB انجام شده است[۷۰]. کوتیناز با حداکثر فعالیت استریفیکاسیون از هگزانول با بوتریک اسید نتایج مشابهی می تواند بدست اید. با این حال فعالیت کوتیناز در میسل معکوس AOT بیشتر از میسل معکوسCTAB است.
استریفیکاسیون هگزانول با اسیدبوریک با بهره گرفتن از جذب کوتیناز Accurel EP-100 حلال­های امتزاج نشدنی با اب (هگزان و diisopropylether) و حلال های امتزاج پذیر در اب (acetonitrile) به وسیله محققان دیگر مورد بررسی قرار گرفته است. این واکنش به عنوان یک سیستم مدل برای مطالعه اثرات متقابل اب و اثر محلول بر روی کوتیناز ، یعنی حلال پوشی با واکنش کننده ها استفاده شده است. نتایج نشان داده است که بهینه فعالیت اب با افزایش قطبیت حلال کاهش یافته است. حلال پوشی سوبستراها به شدت به وسیله اب در استونیتریل تحت تاثیر قرار می گیرند. ثابت Michaelis برای هگزانول در هگزان در دو مقدار aw (۴۴/۰ و ۶۹/۰) به ترتیب ۱۷۰وmM ۲۹۵ بود. این مقادیر بالا از Km بدست امده برای هگزانول در واکنش های کاتالیز شده در میسل معکوس AOT ،Km=86 mM، که ممکن است از اثرات انتشار بالاتر موجود در انزیم حمایت شده هنگامی که با کوتیناز محصور شده درکپسولهایی در حد میکرو مقایسه می شود ناشی شود [۷۳].
استریفیکاسیون هگزانوئیک اسید با هگزانول نیز انجام می شود [۶۳]. در SCCO2 ، این واکنش هنگامی که با سیستم میسلی معکوس CTAB مقایسه می شود بسیار کند است [۷۰]. سرعت واکنش اولیه در SCCO2 به طورقابل توجهی پایین تر بود، همچنین حالت تعادل در محیط واکنش فوق بحرانی تنها پس از ۵ روز بدست آمد.
استریفیکاسیون اسید کاپریلیک با بوتانول همچنین با کوتیناز لیوفیلیزه شده انجام شده است [۷۴]. حدود ۸۰ درصد از استریفیکاسیون می تواند پس از ۷ ساعت بدست اید با بهره گرفتن از ۱H NMR غلظت الکل، استر، هیدروژن هیدروکسیلیک در فاز الی و هیدوژن هیدروکسیلیک در فاز ابی اندازه گیری شد. نتایج ۱H NMR نشان داد که اب تولید شده در اغاز واکنش به وسیله کوتیناز حفظ می شود. بعد از انجام واکنش، این آب سنتز شده با تشکیل یک فاز آبی قابل تشخیص می شود.
سنتز استر از بوتیریک اسید و ۲- بوتانول توسط کوتیناز محصور شده در کپسول هایی در حد میکرو در سورفاکتانت غیریونی فسفاتیدیل کولین انجام شد [۷۱]. فعالیت انزیمی برای سنتز بوتیل بوتیرات با افزایش غلظت سوبسترا بر اساس کینتیک Michaelis–Menten افزایش یافته است. با این حال ۲- بوتانول و اسیدبوتیریک ، به ترتیب غلظت بالاتر از ۵۰۰mM و ۲۰۰mM ، مهار کوتیناز مشاهده شد. ثابت ظاهری Michaelis برای ۲- بوتانول و اسیدبوتریک به ترتیب ۲/۴۷وmM ۸/۳۸ بود. استریفیکاسیون از اسیدلوریک وپنتانول با کوتیناز محصور شده در میسل معکوس AOT انجام شده است [۷۵]. اثر مقدار اب روی فعالیت کوتیناز حداکثر در ۰ ۹ ω نشان داده شده است.

ترانس استریفیکاسیون

واکنش ترانس استریفیکاسیون بوتیل استات با هگزانول در محیط های آلی در چندین سیستم سنجیده شده است [۱]. اثرات شرایط واکنش روی فعالیت های تبادل استری از کوتیناز محصور شده در میکروکپسول­های میسل معکوس AOT با بهره گرفتن از روش های طراحی فاکتریول مورد بررسی قرار گرفت [۷۶].
فعالیت های بالای کوتیناز در ۴۹۰mM هگزانول و برای درجه حرارت ۴۰ تا ۵۰ درجه سانتیگراد نمایش داده شده است. AOT باید در یک غلظت پایین تر به دلیل اثر سمی آن بر روی کوتیناز استفاده شود. با وجود این کوتیناز در میسل معکوس AOT فعالیت بالاتری را نسبت به میسل معکوس CTAB نشان داده است [۷۰] (جدول۲-۵). مقدار pH بین ۷ و ۸ و مولاریته بافر ۲۰۰mM برای واکنش تبادل استری موثر است. مطالعات کینتیکی این واکنش انجام شده و پارامترهای کینتیکی تعیین شد [۱]{Carvalho, 1998 #104}.
واکنش ترانس استریفیکاسیون با جذب کوتیناز روی زئولیت و دیگر بسترهای رایج (پلی امید، سلیس و الومینا) مورد بررسی قرار گرفته است [۶۸]. فعالیت ترانس استریفیکاسیون کوتیناز به عنوان تابعی از فعالیت های اب اندازه گیری شده است. اثرات ترکیب بندی زئولیت و اسیدیته مورد مطالعه قرار گرفت. بیشتر نتایج نشان دهنده این است که بهترین بسترها دارای اسیدیته پایین و سیلیسیم پایین (نسبت الومینیم که مربوط به ترکیب زئولیتNay ) است.
الکل کافت از متیل پروپیونات با پروپانل در یک سیستم جامد/گاز مورد مطالعه قرار گرفت، میزانaw از ۲/۰ به ۶/۰ز تغییر یافت. در کوتیناز رفتار کینتیکی غیرعادی وجود دارد. ارتباط سیگموئیدی مشاهده شده بین نرخ تبادل استری و فعالیت متیل پروپیونات نوعی از فعال شدن همکاری انزیم را توسط یکی از سوبستراها نشان می دهد. بهترین نتایج در aw ۶/۰ بدست امد.
تفکیک انانتیومری مخلوط راسمیک ۱- فنیل اتانول به وسیله کوتیناز جذب شده روی زئولیت NaY درSC CO2 و اتیلن انجام شد [۶۷]. فعالیت کاتالیزوری انزیم به شدت به فعالیت اب وابسته بود، با حداکثرaw ۵/۰و در اتیلن فوق بحرانی بالاتر از SC CO2 بود، با این حال فشار بالاتر از ۳۰۰ بار تاثیری نداشت. انزیم نسبت به R– ایزومر از ۱-فنیل اتانول بسیار انتخابی بود و با یک انانتیومر اضافی به ۱۰۰ درصد می رسد. این یافته ها با مطالعات enantioselectivity قبلی مطابق است که در ان کوتیناز یک نسبت فعالیت R/S تا ۳۰ را نشان می دهد [۵۵]. یک مدل کامپیوتری از ساختارهای حالت انتقالی توسط دو انانتیومر تشکیل شده که توضیح ارجحیت کوتیناز برای اناتیومرR را شرح داده است [۶۷].

پایداری کوتیناز

پایداری حرارتی و عملکردی کوتیناز در اماده سازی انزیم در شرایط واکنش مختلف مورد بررسی قرار گرفته است [۱۱, ۷۳, ۷۵, ۷۷] (جدول ۲-۴). در بسیاری از مطالعات به بررسی میسل معکوس در کوتیناز میکروکپسوله شده، به ویژه در میسل معکوسAOT به دلیل فعالیت های بالای بدست امده پرداخته اند. اولین گزارش روی پایداری کوتیناز محصور شده در میکروکپسول های میسل معکوس AOT نشان داد که نیمه عمر انزیم بسیار کوتاه است. در ω۰ ۱۰ و pH 6/9 در ۲۵ درجه سانتیگراد نیمه عمر ۱۵/۰ ساعت تعیین شد و تنها ۲۰ درصد از فعالیت های اولیه در ω۰ ۲۰ باقی ماندند[۷۸, ۷۹]. این نتایج در مطالعات انجام شده توسط Papadimitriou و همکاران بر تاثیر ω۰ روی پایداری کوتیناز در میسل معکوس ایزواکتان/AOT، ۱/۰M تایید شد (جدول۲-۵). غیر فعال کردن سریع کوتیناز در AOT معکوس شده ی میسلی با توجه به روند برگشت پذیر دناتوراسیون رخ می دهد. دناتوراسیون احتمالا توسط تعامل بین انزیم و رابط سورفاکتانت از میسل معکوس ایجاد می شود، زیرا در محلول ابی، انزیم ازاد تا درجه حرارت ۸۵ درجه را تایید می کند و در غیاب اب (پودر لیوفیلیزه) درجه حرارت بهینه برای ترانس استریفیکاسیون ۸۰ درجه سانتیگراد می باشد [۶۶]. هنگامی که اندازه ی حفره ابی میسلی معکوس تو خالی کوچکتر از کوتیناز باشد(به عنوان مثال ω۰ ۵) یک مدل سه حالته، دناتوراسیون و غیر فعال کردن با یک حالت کنفورماسیونی حدواسط موجود در مسیر کوتیناز طبیعی به دناتوره را توضیح می دهد. در ω۰ ۲۰ نشان داده شده که اندازه میسل خالی بزرگتر از کوتیناز و داده ها توسط یک مدل دو حالته که در انها تنها کوتیناز طبیعی و دناتوره حضور داشتند توصیف شد [۷۹]. استراتژی های تثبیت کننده برای این سیستم انزیمی ایجاد شده است. ویژگی مهمی که تاثیر مثبت بر حفظ فعالیت کوتیناز می گذارد استفاده از الکل،یعنی هگزانول است، که از غیر فعال کردن کوتیناز جلوگیری می کند [۷۳]. نیمه عمر کوتیناز در میسل معکوس AOT حاوی ۲۵۰Mm هگزانول در pH 10 و در ℃ ۱۵ و ω۰ ۴ در حدود ۶۰ روز نشان داده شده است [۷۳]. روشی که در ان کوتیناز محصور شده در میکروکپسول های هگزانول حفاظت می کند هنوز هم مورد بحث و بررسی است.
برای بهینه سازی فعالیت و پایداری کوتیناز در میسل معکوس AOT از طرح فاکتریول استفاده شد [۱, ۱۱]. کوتیناز در ۴۰ درجه سانتیگراد انکوبه شده و یک سطح بالای فعالیت (۹۰درصد) بعد از سه روز هنگامی که مقدار ω۰ ۷/۲ بود حفظ شده است [۱۱]. میزان ω۰ در محدوده ی ۵ تا ۸ فعالیت اختصاصی بهینه دارد. تغییرات شدت فلورسانس وابسته به زمان تایید کرده است که کاهش در مقدار اب، پایداری کوتیناز در میسل معکوسAOT را بیشتر می کند [۱۱].
هگزانول با غلظت ۵۰۰ تا ۶۰۰mM نشان داده شده که برای جلوگیری از غیرفعال شدن کوتیناز ضروری است. عملکرد کوتیناز به شدت تحت تاثیر هگزانول در میسل معکوس AOT است، به طوریکه برای ان نقش های متعددی به عنوان سوبسترا از قبیل یک کوسورفاکتانت و یک تثبیت کننده ایفا می­ کند. اثر هگزانول در مقاومت حرارتی کوتیناز در ۳۰ درجه سانتیگراد و pH 8 و ω۰ ۲/۷ در حضور ۱۵۰mM AOT در ایزواکتان مورد بررسی قرار گرفته است. در عدم حضور هگزانول نیمه عمر ۷/۲ ساعت بدست امده در صورتیکه در حضور ۱۰۰۰mM هگزانول نیمه عمر ۱۵۹ روز تخمین زده شده است [۱]. این به وضوح نقش هگزانول را به عنوان یک تثبیت کننده در سیستم نشان می دهد.
غیر فعال کردن کوتیناز به وسیله ی سورفاکتانت های انیونی در مطالعات SDS تایید شد. آمفی پات­های انیونی مونومری موجب تشکیل سریع یک واسطه غیر فعال برگشت پذیر به علت باز شدن پیچش بخشی از کوتیناز می شود.
جدول ‏۲‑۴ پایداری کوتیناز [۱۱]

فرایندهای در حال توسعه: بیوراکتور کوتیناز

تعداد اندکی از کارهای انجام شده در مورد توسعه فرایند و بیوراکتورهای کوتینازی منتشر شده است[۱۱, ۶۶]. بستر بیوراکتور گاز جامد توسعه داده شد تا واکنش ترانس استریفیکاسیون، انجام تبادل استری متیل پروپیونات و پروپانول با بهره گرفتن از کوتیناز لیوفیلیزه شده به عنوان فاز جامد انجام بگیرد. مطالعات راکتور نسبتا محدود بود به دلیل اینکه هیچ داده ای که اثر سرعت جریان گاز را روی تبدیل نشان دهد ارائه نشده است. از خصوصیات اصلی این مطالعه واکنش مداوم برای ۱۵۰ ساعت در ۶۵ درجه سانتیگراد بدون از دست دادن فعالیت است. عملکرد BSTR ( Batch stirred-tank reactor) برای هیدرولیز تریپسین با کوتیناز جذب شده بر روی زئولیت NaY آنالیز شده است. مطالعات کینتیکی در این نوع راکتور و همچنین اثرات انتقال جرم روی فعالیت آنزیمی انجام شده است. بیشترین مطالعات در یک راکتور غشایی میسلی معکوس (MBR) شامل کوتیناز های میکروکپسوله شده برای ترانس استریفیکاسیون از بوتیل استات با هگزانول انجام شده است. کوتیناز پس از بهینه سازی مطالعات پایداری کوتیناز با ω° و هگزانول یک مولار در میسل های معکوس AOT میکروکپسوله شده است.
نتایج آزمایشات مختلف به وضوح نشان می دهد که به کمک استفاده از محیط آلی و مهندسی راکتور برای غلبه بر غیرفعال شدن کوتیناز توسط سورفاکتانت آنیونی که از کاربردهای بالقوه کوتیناز می­باشد می­توان استفاده کرد. در این شرایط یک پیشرفت قابل توجه در بهبود کوتیناز تثبیت شده دیده شده در حالی که بازده تبدیل بالا نیز بدست امد. سودمندی بالا و ثبات بهره برداری بدست امده از این سیستم راکتور میسلی معکوس امیدی برای فرایندهای بیوترانسفورماسیون است[۱۱].

مکانیسم عمل کوتیناز

مکانیسم عمل به این صورت است که ابتدا سوبسترا از طریق کربن متصل به گروه کربونیل خود به جایگاه فعال متصل می­ شود، سپس سرین سه گانه کاتالیتیک به کربن کربونیل حمله­ی نوکلئوفیلی می­ کند و هیستیدین با جذب پروتون گامای سرین سبب فعال شدن اکسیژن گاما و متعاقب آن آماده کردن آن برای حمله نوکلئوفیلی می­ شود. نتیجه­ حمله­ی نوکلئوفیلی، تشکیل پیوند کوولان بین اکسیژن گامای سرین و کربن سوبسترا و ایجاد حدواسط تتراهدرال است. بار منفی که همزمان با تشکیل حدواسط تتراهدرال به اکسیژن کربونیل منتقل شده با تشکیل پیوند هیدروژنی بین دو گروه آمید سرین و گلوتامین به عنوان دهنده و اکسیژن کربونیل به عنوان گیرنده پایدار می­گردد. به این بخش خاص آنزیم به علت پایدارسازی بار منفی اکسیژن، حفره اکسی آنیون گفته می­ شود.
مرحله نهایی به حمله نوکلئوفیلی آب به پیوند استری بین سرین سه گانه کاتالیتیک و سوبسترا انجام می­ شود. در این مرحله سوبسترا از دهانه فعال آنزیم جدا و خارج می­ شود. با خالی شدن دهانه فعال آنزیم، امکان اتصال سوبستراهای دیگر فراهم می­ شود.
آمینواسید سرین نقش کلیدی در کاتالیز دارد. بقیه ی آمینواسیدها با پایدارسازی بار به این فرایند کمک می کنند. آسپارتات در فاصله نسبتا دوری از سوبسترا واقع شده است و در جایگیری مناسب هیستیدین نسبت به سوبسترا نقش دارد، همچنین با افزایش ثابت اسیدی هیستیدین باعث ایجاد خاصیت بازی می­ شود. مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز در شکل ۲-۱۰ قابل مشاهده است.

شکل‏۲‑۹ مکانیسم عمل کوتیناز [۱۴]
یکی از خصوصیات ویژه آنزیم کوتیناز، فعالیت آن با گستره­ای از سوبستراها­ی مختلف بوده و میزان k­m وmax v این آنزیم در برابر سوبستراهای مختلف مقایسه شده است. جدول ۲-۵ میزان فعالیت آنزیم کوتیناز را در برابر سوبستراهای مختلف نشان می­دهد.
جدول ‏۲‑۵ فعالیت آنزیم کوتیناز در برابر سوبستراهای مختلف [۱۲]

همچنین میزان پایداری TfCa در شرایط دمایی و pH های مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. این مطالعه نشان می­دهد که در شرایط pH=8 و دمایی برابر ۵۰ درجه سانتیگراد آنزیم کوتیناز دارای بالاترین فعالیت در مدت زمان ۱۰۰ ساعت است. در شکل ۲-۱۱ زیر توانایی و میزان مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما و PH قابل مشاهده است

‏۲‑۱۰ گستره­ی مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما وpH [80]
همچنین نمودار میزان فعالیت این آنزیم در دماهای مختلف و میزان فعالیت آن در pH های مختلف مطالعه و بررسی شده است. شکل زیر این نمودارها را نشان می­دهد.

شکل ‏۲‑۱۱نمودار دما و pH [80]

مقایسه­ آنزیم کوتیناز قارچی و باکتریایی

آنزیم کوتیناز از باکتری ترموفیل Thermobifida fusca که در مقایسه با گونه­یfusarium solani دارای پایداری بسیار بالا در حلال­های آلی و پایداری دمایی بیشتری می­باشد دارای فعالیت نزدیک به کوتیناز قارچی در برابر سورفاکتانت ها و یون­های فلزی می­باشد. جدول ۲-۶ میزان فعالیت آنزیم کوتیناز را در برابر سوبسترهای مختلف در دو گونه فوق نشان می­دهد.
جدول ‏۲‑۶ مقایسه­ آنزیم کوتیناز در باکتری ترموبفدا فوسکا و قارچ فوزاریوم سولانی [۱۸]

نشانگرهای ژنتیکی

تنوع ژنتیکی عامل اصلی تکامل یک ژنوم به شمار می­رود. چندشکلی طبیعی ناشی از تغییر توالی­های DNA در ژنوم­های گیاهی و جانوری در بین و داخل یک گونه اساس ایجاد تنوع ژنتیکی می­باشد. در سال­های اخیر پیشرفت­های چشمگیری در زمینه زیست شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی صورت گرفته است که ابزار قدرتمندی را برای پژوهش­های ژنتیک تفضیلی گیاهان عالی از جمله گیاهان زراعی و همچنین اجداد وحشی گیاهان زراعی فراهم کرده ­اند. تفاوت نشانگرهای مولکولی مبتنی بر چندشکلی­های طبیعی است. پس از زمان کشف ساختمان اولیه DNA، در تعدادی از گونه­ ها خصوصیات آن بر محققان مکشوف شده است. چندین سیستم برای آشکارسازی نشانگرهای مولکولی که قادر به شناسایی و برآورد تنوع موجود در توالی­های DNA ژنومی می­باشند، به منظور انجام مطالعات ژنتیکی ابداع و معرفی شده­ است. نشانگرها به دو دسته کلی تقسیم می­شوند.

نشانگرهای مورفولوژیکی

به این نشانگرها، نشانگرهای کلاسیک یا ظاهری هم گفته می­ شود که در واقع همان صفات یا خصوصیات فنوتیپی قابل رویت هستند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می­شوند، می­توانند به عنوان نشانگرهای ژنتیکی مورد قرار می­گیرند. این نشانگرها شامل دامنه وسیعی از ژن­های کنترل کننده صفات فنوتیپی هستند و از نخستین نشانگرها به شمار می­آیند. ولی این نشانگرها دارای محدودیت­های زیادی هستند. به همین دلیل محققین از نشانگرهای دیگر استفاده می­ کنند. از جمله معایب این نشانگرها:

اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی دارند.

تحت شرایط محیطی یا مرحله نمو گیاه قرار می­گیرند.

فراوانی و تنوع کمی دارند.

در بعضی مواقع برای مشاهده و ثبت اینگونه نشانگرها باید زمان طولانی را منتظر ماند.

پایه ژنتیکی بسیاری از نشانگرهای مورفولوژیکی هنوز ناشناخته مانده است.

تنها بخش کوچکی از ژنوم را پوشش می­دهند، بنابراین بخش اعظم نواحی کروموزومی غیر قابل دسترس می­ شود.