۳-۳-۲-۲- شستشوی RNA :

برای خارج کردن کامل کلروفرم، رسوب RNA را با اتانول ۷۵ درصد شستشو داده شد. به این منظور به رسوب RNA مقدار یک میلی لیتر اتانول۷۵ درجه اضافه شده و به آرامی مخلوط گردید. بعد میکروتیوب را به مدت۵ دقیقه در ˚C4 وg 7500 سانتریفوژ کردیم. بعد مایع رویی توسط سمپلر دور ریخته می شود.

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

۳-۳-۲-۳- خشک کردن رسوب RNA :

RNA نباید خیلی خشک شود زیرا حلالیت آن کاهش می یابد. ولی برای خشک شدن نسبی آن ۱۰تا۱۵ دقیقه درب میکروتیوب را باز گذاشته شد و قبل از تبخیر کامل اتانول رسوب RNA در۳۰ میکرولیتر آب مقطر عاری از RNase ریخته شد و سپس به مدت ۱۰ دقیقه بر روی heater با دمای ثابت ۵۵ درجه سانتی گراد قرار گرفت تا RNA به طور کامل حل شود. بعد از آن نمونه ها به مدت چند ثانیه spin شده و بعد از آن روی یخ قرار داده شدند. لازم به ذکر است در تمام مراحل فوق الذکر سعی شد مقادیر به طور دقیق و صحیح رعایت شوند.

۳-۳-۳- ارزیابی کمی و کیفی RNA استخراج شده:

۳-۳-۳-۱- اندازه گیری مقدار RNA :

غلظت RNA با روش تعیین دانسیته نوری(OD[16]) توسط دستگاه Nano drop اندازه گیری شد. RNA را در طول موج های ۲۶۰ و ۲۸۰ ارزیابی گردید. اسید نوکلئیک حداکثر جذب را در nm260دارد و پروتئین های آلوده کننده RNA طول موج nm280 را به خوبی جذب می کنند. یک جذب نوری معادل یک به معنای وجود ۴۰ میکروگرم RNAدر هر میلی لیتر از محصول استخراج شده است.
برای تعیین دانسیته نوری توسط دستگاه Nano drop ابتدا محلول ۱در ۵۰ تهیه شد و سپس دو پایه Nano drop با آب مقطر شستشو داده شد و بعد ازBlank کردن دستگاه از هر یک از نمونه ها که بر روی یخ نگه داری می شدند ۲ میکرو لیتر برداشته شد و پس از آن میزان و خلوص RNA های مورد نظر مورد ارزیابی قرار گرفت.
محلول نهایی تخلیص شده باید OD260 /280 و OD260/230 بیشتر از ۸/۱ داشته باشد. نسبت های کمتر از ۸/۱ بیانگر آلودگی با پروتئین و ترکیبات آروماتیک (نظیرفنل) است. دراینگونه موارد نمونه باید دوباره تخلیص شود.

۳-۳-۳-۲- بررسی کیفی RNA :

برای بررسی کیفیت RNA استخراج شده µg2 از آن را به روش ژل الکتروفورز مورد بررسی قرار دادیم و باندهایS18 و S28 مشاهده گردیدRNA . تام شکسته نشده وقتی روی ژل برده شود دو باند مشخصS28 و S18 مربوط به RNA ریبوزومی به ترتیب در حدود تقریباkb 5/4و۹/۱ دارد. اگر این دو باند مشاهده نشد مواد و وسائل تخلیص RNA باید کنترل شود.

۳-۳-۳-۳- حفظ و نگهداری RNA:

mRNA و یا RNA تام در صورتی که در اتانول رسوب داده شود، برای مدت نسبتاً طولانی در۲۰- درجه سانتیگراد انسجام خود را از دست نمی دهد. برای نگهداری RNA در آب باید از فریز ۸۰- درجه سانتیگراد استفاده کرد.

۳-۴- بررسی بیان ژن:

بررسی بیان ژن ها نیاز به تعیین دقیق میزان mRNA دارد . ابتدا RNA را ، با بهره گرفتن از روش کاملاً شناخته شده نسخه برداری معکوس که در حالت طبیعی توسط ویروس های RNA دار برای تبدیل RNA ژنومی آنها به DNA در داخل سلول میزبان به کار می رود ، تبدیل به DNA تک رشته ای cDNA (complementary) کرده و سپس تکثیر PCR بر روی cDNA انجام می گردد(۷۰).
۳-۴-۱- RT-PCR:
اساس RT-PCR بر آنزیم نسخه بردار معکوس و توانایی آن برای ساخت رشته مکمل از روی mRNA الگو می باشد.اولین مرحله برای انجام RT-PCR انتخاب پرایمر مناسب، آنزیم RT و استفاده از کنترل می‌باشد(۶۴). سه نوع پرایمر برای ساخت cDNA کاربرد دارد:
: Oligo dT.1 رایج­ترین پرایمری است که برای ساخت cDNA استفاده می شود. این پرایمر به توالی مکمل خود در ناحیهء polyA درانتهای ‘۳ رونوشت متصل شده و از این انتها به سمت ابتدای رونوشت رشتهءcDNA ساخته می شود. یکی از معایب پرایمر Oligo dT این است که چون همه mRNA‌ها در انتهای خود پلی A ندارند، تکثیر برخی رونوشت‌ها از دست می‌رود. از سویی به دلیل توالی تکراری A در انتهای UTR ‘ 3 برخی RNA‌ ها ساختمان­های لوپ مانندی ایجاد می‌شود که مانع تکثیر کامل RNA‌ های طویل می­گردد(۶۴).

Random Hexamer: این نوع پرایمر انتهای’ ۳ رونوشت‌های بزرگ را بهتر رونویسی می کند، لذا اگر mRNA ساختار ثانویه داشته یا بزرگ باشد بهتراست از هگزامرهای تصادفی استفاده شود.

الیگونوکلئوتیدهای اختصاصی: این پرایمرها با توجه به توالی خاص هر ژن طراحی می شوند و بیشتر درموارد تشخیصی کاربرد دارند.

دو نوع آنــزیم برای ساخت رشته ی cDNA وجــود دارد: آنــزیم نسخه بردار معکـوس موشی
(M-MuLV) وآنزیم نسخه بردار معکوس پرندگان. (AMV) این آنزیمها از رتروویروسها بدست آمده‌اند و در بخشی از ساختمان خود خاصیت RNase H دارند. فعالیت RNase H در آنزیم نوع پرندگان از آنزیم نوع موشی بیشتر بوده، لذا امکان تجزیه RNA به وسیله آن نیز بیشتراست. دمای بهینه برای آنزیم نوع موشی ˚C 37 و برای AMV، ˚C 42 می باشد. لذا اگر mRNA ساختار ثانویه دارد بهتراست از آنزیم نوع پرندگان استفاده شود،چون در دمای بالاتری ساختمان ثانویه در هم می‌ریزد(۶۴).
در کنار واکنش اصلی ساخت cDNA بهتر است دو نوع کنترل منفی گذاشته شود. درکنترل منفی نوع NTC[17] تمام اجزاء واکنش به جز RNA الگو وجود دارند ولی در کنترل نوع دوم تمام اجزاء واکنش به جز آنزیم RT در واکنش شرکت می‌کنند. اگر در کنترل اول باند دیده شود، نشانه آلودگی خارجی و اگر در کنترل دوم باند دیده شود نشانه آلودگی با DNA می باشد. باید توجه داشت که مقادیر خیلی کم DNA ژنومی می تواند سبب مثبت کاذب در محصول RT-PCR شود. در واقع هیچ روش استخراج RNA نمی تواند محصول بدون DNA دهد. لذا گذاشتن کنترل منفی وتیمار با DNase قبل از شروع مرحله، RT ضروری است(۶۴).
۳-۴-۲-تکثیر cDNA:
مرحلۀ بعدی تکثیر cDNA به وسیله ی PCR می باشد.
۳-۴-۲-۱-PCR(Polymerase Chain Reaction):
PCR (Polymerase Chain Reaction) به معنای واکنش زنجیره پلی مراز، روشی برای تکثیر DNA در آزمایشگاه است.تکنیک واکنش زنجیره پلی مراز (PCR) توسط karry Mullis بیوشیمی دان آمریکایی ابداع گردید که امکان تکثیر یک نمونه کوچک از DNA تا میلیون‌ها برابر را در چند ساعت برای محققین فراهم آورد.
سیکل های مختلف PCR:
۱.مرحله واسرشتی اولیه: در این روش ابتدا با بهره گرفتن از حرارت دو رشته DNA از هم باز می شوند.
۲٫از این مرحله به بعد وارد برنامه چرخه ای PCR می شویم که خود شامل سه مرحله است:
مرحله واسرشتی: این مرحله نیز مانند مرحله واسرشتی اولیه,اما با زمانی کوتاهتر از آن انجام می گیرد. دو رشته DNA بطور کامل در این مرحله از هم جدا می شوند. دمای مورد استفاده در این مرحله ۹۵-۹۴ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰-۲۰ ثانیه است. اگر بی دلیل مدت زمان مرحله واسرشته شدن افزایش یابد این امر سبب کاهش عملکرد آنزیم Taq polymerase می شود.
مرحله اتصال: در این مرحله با پایین آوردن دما و رساندن آن به حد مناسب تلاش می شود تا آغازگرها بتوانند با رشته مکمل خود در DNA الگو جفت شوند. اگر دما بالاتر از حد بهینه باشد اتصال به خوبی صورت نمی گیرد و اگر از حد بهینه پایین تر باشد محصولات غیر اختصاصی تشکیل می شود.به همین خاطر این مرحله مهمترین مرحله در PCR است(۵۷).
مرحله طویل شدن: این دما باید برای فعالیت آنزیم پلیمراز مناسب باشد و در این مرحله رشته مکمل رشته الگو ساخته خواهد شد و از آنجا که رشته های ساخته شده جدید نیز مکمل آغازگرها هستند,این چرخه حرارتی می تواند چندین بار تکرار شود و به همین طریق ساخت و تکثیر قطعات ادامه می یابد. دمای این مرحله ˚C 72 می باشد که برای فعالیت آنزیم پلیمراز مناسب است(۵۷).
۳٫مرحله طویل شدن نهایی : میکروتیوب ها را در دمای ˚C72 به مدت ۱۵- ۸ دقیقه,بسته به طول قطعه مورد نظر قرار می دهند. این عمل جهت کامل شدن طول قطعات تکثیر شده انجام می گیرد(۵۷).
تعداد سیکل:
اگر تعداد سیکل ها از ۱۰ عدد بالاتر و از ۴۰ عدد کمتر باشد به راحتی بر روی ژل قابل رویت است و معمولا برای آزمایشات از ۲۵ تا ۳۵ سیکل استفاده می شود زیرا اگر تعداد سیکل ها بیش از حد زیاد باشد میزان تولید محصولات غیر اختصاصی افزایش می یابد(۵۷).
مواد لازم برای انجام PCR:
DNA الگو: تکثیر از روی نمونه DNA انجام می شود. این نمونه می تواند، قطعه ای DNA ، محصول استخراج DNA ژنومی، DNA پلاسمیدی یا حتی محصول PCR دیگری باشد.
معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از مقدارتعیین شده، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد(۵۷).
کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل ، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گرددو همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بی انجامد(۵۷).
آغازگرها (Primer) : پرایمرها قطعات سنتز شده ای از بازهای آلی اند که بر اساس قطعه مورد نظرDNA الگو ساخته می شوند. طول پرایمرها بسیار مهم است و هر چه طول پرایمر بلند باشد اختصاصی تر عمل می کند. طول پرایمر معمولا bp18 تا bp30 است.
پرایمرها دو عمل انجام می دهند. اول این که محل ژنی را که باید تکثیر شود مشخص می‌کنند و دوم این که اندازه قطعات تکثیر شونده را تعیین می کنند.
غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از ۱۰۰ نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از محدوده، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود.
نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام می دهند بعد از طراحی پرایمر بهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blastآنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژنهای دیگر می توانند همپوشانی داشته و به آنها متصل گردند(۵۷).
بافر: مهمترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم Taq polymerase می باشد. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند.از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA الگو (نمونه) کمک می کند. بافر دارای گلیسرول می باشد که برای مشهود سازی DNA است.
کاتیونهای دو ظرفیتی (یون منیزیم): یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد واثر متقابل رشته DNA الـگــو و آغـازگـر را افـزایـش مـی دهـد. انواع مختلف آنزیم DNA polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. برای تکثیر با Taq polymerase این یون عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش PCR استفاده می شود. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود.
غلظـت کلـریـدمنیـزیـم اثـر زیـادی بـرروی اختصاصی شدن و در نهایت بازده واکنش PCR دارد. غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از مقدارتعیین شده، باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر شده و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود(۵۷).
آنزیمTaq polymerase : این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده است.
به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در ۵۰ میکرو لیتر از واکنش PCR استفاده می شود. اگر نمونه DNAحاوی مواد ممانعت کننده PCR باشد، می توان مقدارتعیین شده را دو تا سه برابر افزایش داد ، ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد(۵۷).
گرچه دمای مناسب برای این آنزیم ۷۰ درجه سانتیگراد می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می باشد، برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد. چون واکنش زمانی به طور کارآمد انجام می شود که DNA پلی مراز بتواند در حین چرخه‌های گرم کردن پایدار بماند,پژوهشگران از یک DNA پلی مراز مقاوم به حرارت تحت عنوان Taq پلی مراز استفاده می کنند(۵۷).
نوکلئوتید ها: چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر ۲۰۰ نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، ۱۰ میلی مولار و ۲۵ میلی مولار موجود است، استفاده می شود(۵۷).
۳-۴-۲-۲- مواد و وسایل مورد نیاز برای ساخت cDNA:
کیت (Fermantas)Revert AID First Strand cDNA Synthesis (جدول ۳-۲ نشان دهده غلظت مواد استفاده شده است)
دستگاه ترموسایکلر گرادیانت (BioRad)
سمپلر
میکروتیوب ۲/۰ سی‌سی
[۱۸]جدول ۳- ۲- غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA

۳-۴-۲-۳- روش انجام آزمایش ساخت cDNA:
در یک میکروتیوب ۲/۰ میلی لیتری استریل فاقد RNase(RNase free) که روی یخ قرار دارد مواد ذکر شده در جدول ۳-۳ به آرامی مخلوط و به مدت ۳-۵ ثانیه spin می­ شود.
جدول ۳- ۳- غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA

حق انحصاری © 2021 مطالب علمی گلچین شده. کلیه حقوق مح