Na.EDTE Fe

نکات:
برای جلوگیری از رشد قارچ و جلبک، استوک­ها در یخچال و در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد نگهداری شدند. طی دوره رشد گیاه، برای جلوگیری از ظهور جلبک بر روی پرلیت و محلول غذایی که یکی از مشکلات کشت­های هیدروپونیک است، اطراف ریشه دانه­رست­ها و روی محلول غذایی، نایلون­های مشکی کشیده شد. با بزرگتر شدن گیاه این مشکل از بین می­رود و نیازی به استفاده از این نایلون­ها نیست.

شکل ۲-۲٫ استفاده از نایلون­های مشکی در اطراف ریشه­ گیاه و محلول غذایی برای جلوگیری از رشد جلبک

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

اعمال تنش خشکی

تنش خشکی توسط پلی اتیلن گلیکول ۶۰۰۰ در غلظت ۲۰% به مدت ۴۸ ساعت اعمال شد.

تیماردهی

پس از ۴۸ ساعت تنش خشکی به مدت ۹ روز تیماردهی به گلدان­ها آغاز شد. به این صورت که به گلدان­های شاهد محلول هوگلند و به سایر گلدان­ها نانوکلات پتاسیم در سه غلظت ۱۵- ۲۵ و ۳۵ ppm به­صورت محلول دهی داده شد.

نمونه­برداری

اولین نمونه برداری قبل از اعمال تنش خشکی صورت گرفت. پس از اتمام تنش، دومین نمونه­برداری انجام شد. سایر نمونه­برداری­ها پس از تنش در انتهای روزهای سوم، ششم و نهم از هر یک از تیمارها صورت گرفت. برگ­ها به­صورت تصادفی در فاصله میان ­گره­های دوم و سوم چیده شدند و داخل فویل قرار داده شدند. نمونه­ها پس از فریز شدن داخل ازت مایع، به فریزر ۷۰- منتقل و تا زمان آنالیز نگهداری شدند.
۲-۹ سنجش پرولین
جهت اندازه ­گیری پرولین مطابق روش بتس و همکاران Bates, et al. 1973)) انجام شد. این روش بر اساس تشکیل یک ترکیب رنگی در اثر واکنش میان اسید آمینه پرولین آزاد و معرفی به نام ناین هیدرین (با فرمول C9H6O4 و جرم مولکولی ۱۵/۱۷۸ گرم بر مول) در شرایط اسیدی و دمای ۱۰۰ درجه سانتی ­گراد و سپس تخلیص این ترکیب رنگی به کمک یک حلال آلی غیر قطبی مانند تولوئن استوار است. در اثر ترکیب پرولین و ناین هیدرین، ماده­ای رنگی به نام دی کتوهیدرین دیلیدین ایجاد می­ شود. شدت رنگ این ترکیب وابسته به مقدار پرولین می­باشد و با اندازه ­گیری جذب نوری می­توان به مقدار پرولین پی برد. در این آزمایش ابتدا ۵/۰ گرم ماده تر گیاهی در ۵ میلی لیتر محلول ۳ درصد سولفوسالیسیلیک اسید ساییده شد. پس از صاف نمودن مخلوط با کاغذ صافی واتمن شماره ۲، ۲ میلی لیتر از آن در لوله آزمایش ریخته و ۲ میلی لیتر معرف اسید نین هیدرین (۲۵/۱گرم نین هیدرین در اسید استیک۲۰درصد) و ۲ میلی لیتر اسید استیک خالص به آن اضافه گردید. لوله­ها به مدت یک ساعت در بن ماری دمای۱۰۰ درجه قرار گرفتند و سپس به حمام یخ منتقل شدند. آنگاه ۴ میلی لیتر تولوئن به هر لوله اضافه شد و پس از تکان دادن لوله­ها، مدت ۲۰ ثانیه ثابت نگه داشته شدند تا اینکه دو لایه مجزا تشکیل شد. سرانجام جذب لایه فوقانی (حاوی تولوئن و پرولین) در طول موج ۵۲۰ نانومتر خوانده شد و مقدار پرولین با بهره گرفتن از منحنی استاندارد تعیین شد.
منحنی استاندارد با در دست داشتن غلظت­های مختلف پرولین و جذب هر کدام از غلظت­ها رسم و معادله منحنی استاندارد به­دست آمد.

منحنی استاندارد پرولین
۲-۱۰ سنجش پروتئین کل به روش برادفورد
۲-۱۰-۱ تهیه معرف[۱] برادفورد:
معرف برادفورد شامل۱۰۰میلی گرم پودر کوماسی بریلیانت بلو G-250 ،۵۰ میلی گرم اتانول ۹۶%. ۱۰۰میلی لیتر اسید فسفریک (w/w)85 درصد می باشد. این سه ماده را با هم مخلوط کرده و به حجم ml 200 می­رسانیم. به این ترتیب محلول x5 به­دست می ­آید که باید در ظرف تیره نگهداری شود. در زمان آزمایش، محلول فوق را ۵ بار رقیق می­کنیم تا محلول x1 به­دست آید.
برای تهیه محلول استوک mg/ml1 آلبومین سرم گاوی (BSA)، مقدار معینی (۱میلی گرم) از این پروتئین را در ۱ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و در زمان استفاده آن را ده برابر رقیق می­کنیم. حال از این غلظت در لوله‏های آزمایش به­ترتیب۰، ۵، ۱۰، ۱۵، ۲۰، ۲۵، ۳۰ و ۳۵ و۴۰و ۴۵ ماکرولیتر BSA می­ریزیم و با آب مقطر به حجم ۵۰ می­رسانیم و به هر کدام ml 5/2 محلول برادفورد x1 با رعایت فاصله­ی زمانی ۲ دقیقه اضافه می‏کنیم و به مدت ۲۵-۳۰ ثانیه لوله­ها را ورتکس می­کنیم. بعد از ۱۵ دقیقه جذب لوله­ها در طول موج ۵۹۵ نانومتر با ر عایت همان مقدار فاصله­ی زمانی با اسپکتروفتومتر می­خوانیم. به این ترتیب منحنی استاندارد (جذب علیه (mg/ml)BSA)رسم شده و به کمک آن و با بهره گرفتن از شیب خط منحنی، غلظت پروتئین کل محاسبه شد.

۲-۱۱ سنجش کلروفیل و کاروتنوئید
۵/۰ گرم برگ تر از هر تکرار توزین شده و توسط نیتروژن مایع در داخل هاون چینی آسیاب شد و به آن ۵ میلی­لیتر استون ۸۰ درصد (۲۰ آب مقطر: ۸۰ استون) اضافه گردید. مخلوط به دست آمده به مدت ۱۵ دقیقه با دور (rpm)3000 در دمای ۴ درجه سلسیوس سانتریفیوژ گردید. در نهایت عصاره استونی شفاف جدا شده و حجم آن با استون خالص به ۵ میلی لیتر (حجم اولیه) رسانده شد. سپس شدت جذب محلول در طول موج­های ۴۷۰، ۶۴۶ و ۶۶۳ با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر (CamSpec M501 UV/Visible) در مقابل شاهد قرائت شد. در نهایت برای تعیین مقدار کلروفیل و همچنین کاروتنوئید کل از فرمول­های زیر استفاده شد (Lichtenthaler, 1987).
Chl.a= (12.25 A663–۲٫۷۹ A646) ×V/W
Ch1.b=(21.50 A646–۵٫۱ A663)×V/W
Chl.T= Chl.a + Chl.b
Car.=(1000 A470 – ۱٫۸۲ Chl.a – ۸۵٫۰۲ Chl.b)/198×V/W
که در روابط بالا V حجم استن به میلی لیتر و W وزن تر برگ بر حسب گرم می‌باشد. غلظت کلروفیل و کاروتنوئید کل برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ می­باشد.
۲-۱۲ اندازه ­گیری مالون دی آلدهید
برای این منظور ۵/۰ گرم از بافت برگ در هر تکرار با ml5 تری کلرواستیک اسید ۵% ساییده شد. عصاره حاصل، به مدت ۱۵ دقیقه، در دمای اتاق و با دور rpm)) 14000 سانتریفیوژ شده و سپس محلول رویی توسط سمپلر جدا شد. پس از آن به حجم مساوی از محلول رویی (سوپرناتانت) TCA20درصد حاوی۵/۰ درصد TBA افزوده گردید. مخلوط حاصل به مدت ۳۰ دقیقه در حمام آب جوش با دمای ۱۰۰ درجه سانتی ­گراد قرار داده و بلافاصله درظرف یخ سرد شد؛ سپس ۲۰۰۰ میکرولیتر از سوپرناتانت به میکرتیوپ منتقل و به مدت ۵ دقیقه در دور rpm)) 7500 سانتریفیوژ شد. سپس جذب کمپلکس MDA+TBA در nm 532 قرائت شد. جذب بقیه رنگیزه­های غیراختصاصی در nm 600 تعیین شد و از میزان جذب در nm 532 کسر گردید. برای محاسبه غلظتMDA از ضریب خاموشی mM-1cm–1155 استفاده شد و در نهایت مقدار مالون دی آلدهید که محصول واکنش پراکسیداسیون لیپیدهاست، بر اساس نانو مول در گرم وزن تر محاسبه شد.
۲-۱۳ استخراج آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی
به منظور استخراج عصاره آنتی اکسیدان­های غیر آنزیمی مثل فنل از متانول ۸۰% استفاده شد. ابتدا برگ توتون را به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۸ درجه سانتی ­گراد در آون قرار داده تا نمونه­ها کاملا خشک شوند. سپس نمونه­ها را در هاون چینی ریخته و به خوبی کوبیده شد تا کاملا خرد شوند. سپس ۵/۰ گرم از هر نمونه آسیاب شده وزن شده و به لوله­های شیشه ­ای دارای برچسب با ذکر مشخصات انتقال داده شد. سپس به لوله­ها ۵ میلی لیتر متانول ۸۰% اضافه و به­آرامی مخلوط شد. نمونه­ها ۲۴ ساعت در دمای ۲۵ درجه شیک شدند. بعد از سپری شدن این زمان، عصاره­ها با بهره گرفتن از کاغذ صافی واتمن، صاف شده و عصاره­های صاف شده به مدت ده دقیقه در دور (rpm) 1500 سانتریفیوژ شدند. بعد از سانتریفیوژ، محلول رویی با دقت برداشته شده و به لوله­های شیشه ­ای با ذکر مشخصات انتقال داده شدند. سپس در یخچال با دمای ۴ درجه سانتی ­گراد برای مراحل بعدی نگهداری شدند.
۲-۱۳-۱ سنجش آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی
از بین آنتی اکسیدان­های غیر آنزیمی، سنجش غلظت فنل نمونه­ها با روش رنگ­سنجی و با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر انجام شد.
۲-۱۳-۱-۱ سنجش فنل تام
سنجش مقدار فنل تام با بهره گرفتن از روش Gaoو همکاران انجام شد که نیازمند استفاده از معرف Folin-Ciocalteu و استاندارد گالیک اسید است. برای این منظور ۱۰۰ میکرولیتر عصاره در داخل لوله شیشه ­ای ریخته شد. سپس ۲۰۰ میکرولیتر حلال فولین و ۲۰۰۰ میکرولیتر آب مقطر به آن اضافه شد. پس از گذشت ۳ دقیقه، ۱۰۰۰ میکرولیتر کربنات سدیم ۲۰% در غیاب نور اضافه شد. در نهایت نمونه­ها به مدت یک ساعت در تاریکی و در دمای اتاق گذاشته شدند. بلانک نیز به همین ترتیب با ۱۰۰ میکرولیتر حلال به­جای عصاره آماده شد. بعد از صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر با بلانک، جذب نمونه­ها در طول موج ۷۶۵ نانومتر خوانده شد.
۲-۱۳-۱-۲ رسم منحنی استاندارد گالیک اسید
جهت به­دست آوردن غلظت فنل تام نمونه، از منحنی استاندارد گالیک اسید استفاده شد. غلظت­های مختلف گالیک اسید شامل: ۲۵، ۵۰، ۷۵ و ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر تهیه شد. به این ترتیب که غلظت گالیک اسید ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر را با متانول ۵۰% تهیه کرده و سایر غلظت­ها مطابق جدول (۲-۴) آماده شدند.
جدول ۲-۴

حق انحصاری © 2021 مطالب علمی گلچین شده. کلیه حقوق مح