۱-۸ بررسی فیتوشیمیایی گیاهان مورد استفاده
فیتوشیمی[۴۰] علمی است که به بررسی ترکیبات آلی که توسط گیاهان تولید و در آن­ها ذخیره می­ شود، می ­پردازد یا به­عبارت دیگر علمی که به ساختار و وضعیت مواد مؤثر گیاهان دارویی، تغییرات و سیستم تبدیل آن­ها در طول زندگی گیاه و سپس در طول مدت انبار شدن و تهیه داروهای گیاهی می ­پردازد [۶۶].
مواد مؤثره گیاهان دارویی دو نوع هستند:

مواد حاصل از متابولیسم اولیه یا مواد مورد نیاز و حیاتی که در همه گیاهان سبز با عمل فتوسنتز به­وجود می­آید.

مواد حاصل از متابولیسم ثانویه که در اثر جذب ازت توسط گیاه تولید می­ شود. این تولید­ها ظاهرا برای گیاه بدون فایده هستند ولی برعکس اثرات درمانی آن­ها قابل توجه است. منظور از این ترکیبات اسانس ­های روغنی، رزین­ها و آلکالوئیدهای مختلف است.
جهت دانلود متن کامل پایان نامه به سایت azarim.ir مراجعه نمایید.

۱-۸-۱ آلکالوئیدها
برای نخستین بار یک محقق آلمانی از آلکالوئیدها به عنوان ترکیبات نیتروژن­دار ناجورحلقه که خاصیت قلیایی دارند و در محیط اسیدی تولید نمک می­نمایند، نام برده است. آلکالوئیدها در انسان واکنش­های فیزیولوژیکی قوی همراه با اثرات مخصوص ایجاد می­ کنند که روی سیستم عصبی اثر می­گذارند. آلکالوئیدها بسیار متنوع می­باشند، به طوری که تعداد آلکالوئیدهای شناخته شده موجود در گیاهان بر چند هزار بالغ می­گردد. اولین آلکالوئیدها در بین سال­های ۱۸۱۶-۱۸۰۳ از پیکر گیاهان جدا گشت. در سال­های اخیر نیز بعضی آلکالوئیدهای جدید مورد شناسایی قرار گرفته­اند. آلکالوئیدها را بر حسب خصوصیات بیوشیمیایی و شیمیایی در سه گروه قرار می­دهند:

آلکالوئیدهای حقیقی: که منشا آن­ها اسیدهای آمینه و ترکیب­های شیمیایی هتروسیکلیک نیتروژن­دار می­باشند.

پروتوآلکالوئیدها: این دسته از آلکالوئیدها از اسیدهای آمینه ساخته شده و محتوی ترکیبات شیمیایی نیتروژن­دار خطی (غیر حلقوی) می­باشند.

آلکالوئیدهای کاذب: این دسته از آلکالوئیدها از اسیدهای آمینه تشکیل نشده ­اند ولی در ساختمان آن­ها نیتروژن وجود دارد [۶۷].

اولین مثالی که از آلکالوئیدهای مفید پزشکی می­توان نام برد مرفین است که در سال ۱۸۰۵ از گیاه Papaver somniferum استخراج شد. هروئین و کدئین نیز هر دو مشتقاتی از مورفین­اند. بربرین یکی از نمایندگان مهم گروه آلکالوئیدهاست که علیه تریپانوزوم و پلاسمودیوم مؤثر است. مکانیسم عمل آن­ها در مهار میکروب از طریق قرار گرفتن بین جفت بازهای DNA است [۶۸].
۱-۸-۲ آنتوسیانین­ها
آنتوسیانین­ها از نظر شیمیایی متعلق به فنل­ها می­باشند. آنتوسیانین بانی رنگی بودن و قرمز بودن تعدادی از گل­ها می­باشند. از آن جایی که آنتوسیانین­ها در شیره­ سلول­های گیاهی محلول و در مواد مختلف به سادگی قابل حل نیستند از این رو خارج ساختن آن­ها از پیکر سلول مشکل است و این، یکی از دلایل انجام نشدن مطالعات کافی در مورد تاثیر آن می­باشد [۱۵]. آنتوسیانین­ها از دیگر ترکیبات فنلی مشتق شده از مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها می­باشد که در آخرین نقطه مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدها ساخته می­ شود و در جاروب­کردن گونه­ های فعال اکسیژن در تنش­ها نقش دارد و آنتوسیانین با کلات­کردن یون­های آهن از تولید رادیکال­ها ممانعت می­ کند. هم­چنین در جذب حشرات و جلوگیری از نفوذ اشعه UV به درون سلول نقش اساسی بازی می­ کند. آنتوسیانین هم­چنین دارای خواص دارویی بوده و خواص آنتی­اکسیدانی، ضد التهابی در آن­ها به اثبات رسیده است [۶۹].
۱-۸-۳ تانن­ها
تانن­ها به ترکیبات متفاوتی اطلاق می­ شود که عموما سخت و گس و قابض­اند و توانایی پیوستگی به پروتئین­ها را دارند و سبب رسوب آن­ها می­گردند و به لحاظ داشتن این خاصیت قرن­هاست که جهت تبدیل پوست حیوانات به چرم در دباغی مورد استفاده قرار می­گیرند. تانن­ها با وزن مولکولی بسیار کم به چند دسته کلی تقسیم می­شوند: تانن­های هیدرولیز شونده، تانن­های متراکم و تانن­های کاذب. این مواد به طور کلی از فرآورده ­های ثانویه بازمانده از چرخه­های متابولیکی گیاهان محسوب می­شوند. از خاصیت سختی و قابض­بودن تانن­ها می­توان به عنوان ضد اسهال­های معمولی، اسهال­های خونی مزمن، التیام زخم­ها و عفونت­های مربوط به گلو و نای (لوله­های گوارشی و تنفسی) استفاده نمود [۶۷].
۱-۸-۴ ساپونین­ها
ساپونین­ها گلیکوزیدهایی با وزن مولکولی زیاد هستند. این مواد به صورت محلول در آب کف می­ کنند از این رو ساپونین­ها خاصیت پاک­کنندگی دارند (ساپونین از کلمه لاتین ساپو به معنای صابون گرفته شده است). ساپونین­ها وقتی وارد گردش خون می­شوند سبب همولیز گلبول­های قرمز خون می­گردند، از این رو بهتر است مصرف آن­ها به عنوان یک مادّه نسبتا سمّی تحت نظر قرار گیرد. ساپونین­های استروئیدی که در برخی از گیاهان تیره سوسن، آماریلیس و تیره­های دیگر وجود دارد نقش عمده­ای را در صنایع جدید دارویی مخصوصا در ارتباط با ساخت و عرضه گلیکوزیدهای قلبی موجود در برخی گیاهان ایفا نمایند [۷۰].
۱-۸-۵ فنل­ها
در میان ترکیبات آنتی­اکسیدان گیاهی، ترکیبات فنولی توزیع گسترده­ای در بسیاری گیاهان دارند. این ترکیبات، گروه متنوعی از متابولیت­های ثانویه هستند که در تمامی مراحل رشد گیاه و هم­چنین در پاسخ به شرایط تنش­زا از جمله بروز بیماری، آسیب به بافت، حمله آفات، کم­آبی و یا تابش اشعه فرابنفش در گیاه تشکیل می شوند [۷۱]. پژوهش­ها نشان داده­اند که فعالیت آنتی­اکسیدانی و هم­چنین اثرات درمانی گیاهان به طور عمده ناشی از حضور این ترکیبات می­باشد [۷۲].
ترکیبات فنولی قادرند از طریق مهار رادیکال­های آزاد، احیای یون­های فلزی، غیرفعال­کردن اکسیژن یگانه و سه­گانه و یا تشکیل کمپلکس با یون­های فلزی واکنش­های اکسیداسیون ترکیبات لیپیدی را مهار کنند [۷۳].
در کنار فعالیت آنتی­اکسیدانی، اثرات ضد میکروبی قابل توجهی از این ترکیبات گزارش شده است. ویژگی­های ضد میکروبی ترکیبات فنولی به واسطه توانایی آن­ها در تغییر نفوذپذیری غشای سلول­های میکروبی و به دنبال آن خروج ترکیبات درون سلولی از جمله ریبوز و یا گلوتامات سدیم، تغییر در عملکرد غشاء جهت انتقال الکترون و یا دریافت مواد مغذی، اختلال در فعالیت سنتز پروتئین­ها و آنزیم­ های میکروبی می­باشد [۷۴]. از آن جا­ که تهیه ترکیبات فنولی به صورت خالص فرایند نسبتا دشواری است و عموما عصاره­های فنولی در مقایسه با فرم خالص یک نوع ترکیب فنولی فعالیت آنتی­اکسیدانی بالاتری دارند، استخراج عصاره­های گیاهی و استفاده از آن­ها به عنوان ترکیبات آنتی­اکسیدانی رواج یافته است [۷۵].
۱-۸-۶ فعالیت آنتی­اکسیدانی
ROS شامل همه مولکول­های بسیار واکنش­پذیر حاوی اکسیژن، مانند رادیکال­های هیدروکسیل، پراکسید هیدروژن، رادیکال آنیون سوپراکسید، رادیکال اکسید نیتریک، رادیکال هیپوکلریت و پراکسید چربی­های مختلف می­باشند. این مولکول­ها می­توانند با لیپیدهای غشاء، اسیدهای نوکلئیک، پروتئین­ها، آنزیم­ها و دیگر مولکول­های کوچک واکنش داشته باشند. رادیکال­های آزاد در غلظت پائین و یا متوسط اثرات مفیدی بر روی پاسخ­ها و عملکرد سیستم ایمنی بدن دارد. به عنوان مثال در زمینه انتقال سیگنا­ل­ها، بیان ژن و تنظیم فعالیت گوانیلات سیکلاز در سلول­ها نقش اساسی دارند. اما در سطوح بالا، می ­تواند منجر به اکسیداسیون کنترل نشده اسیدهای نوکلئیک، پروتئین­ها، کربوهیدرات­ها و لیپیدهای غشایی گردند که در نهایت منجر به آسیب ساختارهای سلولی و به هم خوردن متابولیسم می­شوند [۷۶، ۷۷].
۱-۹ اهداف پژوهش
با توجه به این که از نیمه قرن گذشته، تحقیقات فارماکودینامیک زیادی روی گیاهان دارویی در بیشتر کشورهای جهان انجام گرفته و در پی آن داروهای گیاهی فراوانی تهیه و به بازار عرضه گردیده است، بنابراین مطالعه روی ترکیبات فلور ایران حائز اهمیت می­باشد.
با توجه به مشکلات موجود در کاربرد داروهای سنتتیک از جمله دستیابی به داروهای جدید و هم­چنین عوارض جانبی داروهای موجود، توجه بسیاری از محققین علوم دارویی به استفاده از ترکیبات طبیعی معطوف گشته است که این امر با بررسی اثرات درمانی و شناسایی ترکیبات مؤثره موجود در آن­ها قابل حصول و دسترسی می­باشد.
شناخت حدود ۰۰۰/۶۲۰ گونه گیاهی در جهان و وجود چندین ماده شیمیایی در هر گیاه، نشان­دهنده وسعت مواد مؤثره طبیعی می­باشد که شاید کمتر از ۱% آ­ن­ها شناسایی شده ­اند. از مواد مؤثره گیاهان به عنوان داروهای ضد میکروبی، ضد قارچ، ضد درد و ضد التهاب استفاده می­ شود.
برای رسیدن به چنین اهدافی در این پایان نامه ، اثرات ضدمیکروبی ۵ عصاره گیاهی روی ۴ سوش باکتریایی و آزمایشات فیتوشیمیایی آن­ها مورد بررسی قرار گرفته است.

انجام آزمایشات ضد میکروبی جهت تشخیص مواد آنتی­بیوتیکی موجود در آن­ها

انجام آزمایشات فیتوشیمی جهت مشخص کردن موادّ مؤثره موجود در آن­ها

تعیین بهترین گیاه با ارزش و قابل توجه از بین گیاهان مورد بررسی و استفاده آن از نظر تولید ماده اولیه دارویی و بررسی آن جهت خودکفائی و استقلال صنایع دارویی کشور

از بین عصاره­های گیاهی مورد بررسی، اثرات ضد میکروبی و شناسایی ماده مؤثره عصاره گیاه بادام کوهی، مورد بررسی کامل قرار نگرفته است که می ­تواند به عنوان دستاوردی نوین مورد اهمیت قرار گیرد. ما احتمال می­دهیم اثر مهارکنندگی عصاره­های مورد بررسی به دلیل تولید متابولیت­های ثانویه و ترکیبات آنتی­اکسیدانی در آن­ها باشد.
فصل دوم
مواد و روش­ها
۲-۱ مواد اولیه و تجهیزات مورد نیاز
سویه­های استاندارد:
اشرشیا کلی، سالمونلا انتریتیدیس به عنوان باکتری­ های گرم منفی و استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس به عنوان باکتری­ های گرم مثبت به صورت لیوفیلیزه از شرکت انستیتو پاستور ایران خریداری شدند.
دیسک­های آنتی­بیوتیک استاندارد:
پنی­سیلین، جنتامایسین، تتراسایکلین، اریترومایسین، تری­متوپریم، سولفامتوکسازول و استرپتومایسین و دیسک­­های بلانک از شرکت پادتن طب خریداری شد.
کلیه مواد شیمیایی و حلال­های مورد استفاده در این پژوهش:
دی متیل سولفوکساید[۴۱]، متانول، مولر هینتون آگار[۴۲]، مولر هینتون براث[۴۳]، نوترینت براث[۴۴]، نوترینت آگار[۴۵]، نیتروبلو تترازولیوم کلراید[۴۶] از شرکت مرک[۴۷] و اسیدآسکوربیک، فریک کلراید، تری کلرو استیک­اسید، پتاسیم فری­سیانید، بافر فسفات، دی­فنیل پیکریل هیدرازیل، اسیدگالیک، کربنات سدیم، یدید پتاسیم، فولین-سیوکالتیو، ید، سود، فنیل فتالئین، روی، اسید کلریدریک، آمونیاک، سدیم کلراید، کلروفریک، اتیل­اتر با درجه خلوص بالا تهیه شد.
دستگاه­های مورد استفاده در این پژوهش:
اسپکتروفتومتر، انکوباتور، آسیاب برقی، روتاری، شیکر، هود لامینارفلو، ورتکس، یخچال، اتوکلاو، ترازو دیجیتال آزمایشگاهی، ترازو دیجیتال با دقت ۰۰۰۱/۰ گرم، سانتریفیوژ، بن­ماری، آون و PH متر بود.
۲-۲ تهیه گیاهان مورد بررسی و تعیین نام علمی آن­ها
گیاهان مورد مطالعه در این پژوهش: بادام کوهی (Amygdalus scoparia)، بومادران (Achillea millefolium)، کلپوره (Teucrium polium)، گلپر (Heracleum persicum) و مریم­گلی (Salvia officinalis).
تعیین نام علمی: این مرحله بسیار حساس بوده و لزوما باید توسط شخص مجرب و متخصص صورت گیرد. جهت تعیین نام علمی نیاز به وجود یک یا چند نمونه از گیاه می باشد. گیاه شناس ابتدا به تشخیص راسته، تیره و سپس جنس گیاه پرداخته که در صورت وجود نمونه کامل و مناسب تا این مرحله شناسایی سریعا انجام می گیرد. تعیین گونه و احیانا واریته دقت زیادی را می طلبد و به کمک کتب مرجع، مقایسه با دیگر نمونه های هرباریومی و بررسی میکروسکوپی و غیره صورت می گیرد. پس از شناسایی نام علمی توسط متخصصین گیاه­شناس، نمونه­ها به آزمایشگاه فیزیولوژی برای آزمایش­های میکروبی منتقل شد.
آسیاب کردن: بخش­های مورد استفاده خشک­شده این گیاهان جهت تهیه عصاره، به وسیله آسیاب برقی خرد شده و با بهره گرفتن از الک به صورت پودر درآمدند تا سطح تماس بیشتری با حلال داشته باشند.
۲-۳ استخراج عصاره متانولی
پودر ۱۰۰ گرم از بخش­های مختلف رویشی و زایشی گیاهان مورد بررسی، در ۵۰۰ میلی­لیتر متانول ۸۰% به مدّت ۴۸ ساعت روی دستگاه شیکر (مخلوط را یکنواخت می­گرداند) در دمای ۴۰-۳۷ درجه سانتی ­گراد با دور ۲۷۰ در دقیقه به روش ماسراسیون، عصاره­گیری شدند. دلیل استفاده از خیساندن، عدم آسیب مواد موجود در عصاره تهیه شده از گیاهان بوده است [۷۸]. در طول این فرایند سعی شد تا با هم­زدن، عصاره یکنواختی حاصل شود [۷۹]. عصاره حاصل با کاغذ واتمن ۴/۰ میکرونی صاف گردید. بقایای گیاهی مجددا با متانول به مدت ۲۴ ساعت دیگر با همان شرایط قبلی تحت عملیات استخراج قرار گرفت و محلول صاف شده به عصاره اولیه اضافه شد. عصاره متانولی تحت شرایط خلاء در دمای ۵۰ درجه سانتی ­گراد با دور ۸ در دقیقه توسط دستگاه روتاری[۴۸] تغلیظ و در پتری­ دیش­های استریل ریخته و در دمای ۵۰ درجه سانتی ­گراد آون خشک گردید [۸۰]. عصاره­ها پس از سپری­شدن ۴ روز به صورت خشک با نسبت وزنی متفاوت از گیاهان مختلف تهیه شدند.
۲-۴ روش تهیه محیط­های کشت
محیط کشت جامد مولر هینتون آگار:(۶٫۸ g/ 200 ml) 34 g/ l
محیط کشت مایع مولر هینتون براث: (۲٫۱ g/ 100 ml) 21 g/ l
محیط کشت نوترینت آگار: ۵۲ g/ l
محیط کشت نوترینت براث: ۳۷ g/ l
مقدار معینی از محیط کشت را با آب مقطر استریل به حجم رسانیده و پس از سترون­کردن با اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد جهت ادامه کار مورد استفاده قرار می­دهیم.
۲-۵ استریلیزاسیون محیط­های کشت میکروبی، ظروف و مواد مصرفی
تمامی وسایل و مواد مورد نیازی که قبل از استفاده، نیاز به سترون­شدن دارند از جمله: فالکن، میکروتیوب، لوله­های آزمایش، سرسمپلر و محیط­های کشت جامد و مایع قبل از تلقیح باکتری به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد اتوکلاو شدند. محلول­های ذخیره نمک­های فلزات و حلال­های آلی به­ این دلیل که سترون­سازی از طریق اتوکلاو می ­تواند منجر به تغییر ساختار نمک و یا تبخیر حلال شود، به وسیله فیلتر ۲/۰ میکرونی استریل شدند.
۲-۶ احیاء باکتری
قبل از هر آزمون میکروبی، زیر هود لامینارفلو قسمت ­های سطحی هود با پنبه آغشته به الکل ۷۰% استریل و به مدت ۲۰ دقیقه تحت اشعه UV قرار گرفت. آمپول لیوفیلیزه حاوی میکروارگانیسم­های مورد مطالعه را در شرایط استریل شکسته و با حدود ۲-۱ میلی­لیتر محیط کشت نوترینت براث به صورت سوسپانسیون درآمد. چند قطره از این سوسپانسیون توسط سرنگ استریل به محیط کشت جامد نوترینت آگار منتقل گردید تا بعد از رشد ۲۴-۱۸ ساعته در گرمخانه دما به عنوان کشت ذخیره[۴۹] از آن استفاده گردد.
۲-۷ تهیه کشت تازه (در فاز لگاریتمی) از میکروارگانیسم­ها