۲-۲-۴- عامل بیماری
این بیماری در اثر گونه های مختلف Verticiliumمثل V. dahliae، V. albo-atrum، V. tricorpus ، V. nigrescens و V. nubilum ایجاد شده، ولی V. dahliae Kleb گونه غالب بیماری است.
قارچ عامل بیماری خاکزی بوده و تولید اندامهای پایا کرده که باعث ماندگاری و بقای آن در خاک می شود. این گونه V. dahliae دارای دو دو سویه برگریز و غیربرگریز است.
۲-۲-۴- ۱- خصوصیات ظاهری V. dahliae
۲-۲-۴- ۱- ۱- کلنی، ریسه، کنیدیوفور و اسپور
عامل بیماری روی محیط کشتهای مختلف رشد می کند. خصوصیات ظاهری کلنی در جدایههای V. dahliae متغیر است (ملکی زیازتی و همکاران، ۱۳۸۶). براساس گزارش عطار (۱۳۸۵) بعضی از جدایهها هیفهای خوابیدهای داشته و میکرواسکلروتهای فراوانی تولید کرده و برخی ریسههای هوایی فراوان و میکرواسکلروتهای کمی را بوجود میآورند.
رضوی و همکاران (۱۳۷۷) در بررسی کشتهای تک اسپور دو جدایه برگریز و غیربرگریز قارچ عامل بیماری بر روی PDA، در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد و تاریکی، نشان دادند که در مواردی کلنیها در کشتهای تک اسپور، با جدایه مادری از نظر تولید میزان ریسه هوایی و میکرواسکلروت متفاوت هستند.
گونه های مختلف ورتیسیلیوم ریسههایی با دیواره عرضی تولید می کنند. اکثر سلولهای ریسه تک هستهای و هاپلوئید بوده و در دیواره عرضی دارای منفذ مرکزی ساده است. قارچ دارای کنیدیوفورها فراوان، کم و بیش مستقیم، منشعب و شفاف است. کنیدیها به صورت مجتمع در یک لعاب موسیلاژی بر روی سلولهای اسپورزای طویل شده بهنام فیالید بوجود میآیند. فیالیدها بصورت فراهم با ۳-۴ سلول اسپورزا در هر گره بر روی انشعابات هوایی کنیدیوفور تولید میشوند (شکل ۲-۲). انشعابات ثانویه نیز در بعضی از فیالیدها گزارش گردیده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳).
|
شکل ۲-۲- نظم کنیدیوفور، فیالید و کنیدیهای قارچ ورتیسیلیوم (Agrios, 2005) |
کنیدیها تک سلولی، تخم مرغی تا بیضوی و شفاف هستند. اندازه کنیدیها ۳/۱-۲ × ۵/۳-۶ میکرومتر میباشد (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ عطار، ۱۳۸۵؛ ملکی زیارتی، ۱۳۸۶).
۲-۲-۴- ۱- ۲- میکرواسکلروت
در V. dahliae سلولهای ریسه با تقسیمات متوالی، سلولهای متورم، تقریباً گرد تا بیضوی را بوجود میآورند که با اضافه شدن ملانین به آنها مجموعه ای به نام میکرواسکروت را تشکیل می دهند (Brown and Wyllie, 1970).
تشکیل شدن میکرواسکلروت در خاک باعث پایداری عامل بیماری می شود. میکرواسکلروتها به رنگ قهوهای تیره تا سیاه، به اشکال مختلف (گرد، بیضی کشیده تا نامنظم) بوده و در اندازه های ۱۵-۱۰۰ میکرومتر وجود دارند (رضوی و همکاران، ۱۳۷۷). میکرواسکلروتهای جدایههای گرگان کروی تا بیضوی کشیده و به اندازه ۳۰-۷۰ میکرومتر گزارش شدند (عطار، ۱۳۸۵؛ ملکی زیارتی، ۱۳۸۶).
تفاوت ریخت شناسی در رابطه با میکرواسکلروتها در جدایههای این قارچ، به خصوص در گروه های سازگار رویشی بیان شده است (Korolev et al., 2000). ابراهیمی و همکاران (۱۳۷۷) نشان دادند که میکرواسکلروتها در جدایههای برگریز کشیدهتر از جدایههای غیر برگریز میباشند. در هر میکرواسکلروت تعداد کمی از سلولها به صورت بیرنگ (فاقد ملانین) باقی میمانند که مسئول جوانه زدن میکرواسکلروت هستند (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳).
۲-۲-۴- ۲- نیازهای رشدی در محیط کشت
۲-۲-۴- ۲-۱- دما
دما یکی از مهمترین عوامل محیطی موثر در خصوصیات فیزیولوژیکی قارچها میباشد. تاکنون تاثیر دما در میزان رشد رویشی، توانایی اسپورزایی، توانایی بیماریزایی و تولید توکسینهای بیماریزای گیاهی در برخی از عوامل بیماریزای گیاهی، ازجمله V. dahliae به اثبات رسیده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ عراقی و همکاران، ۱۳۸۸؛ عطار، ۱۳۸۵؛ Izabella et al., 2007؛ Sanei et al., 2004).
رشد جدایههای قارچ V. dahliae بسته به نوع جدایه و توان بیماریزایی آن، متفاوت است. بهینه دمای رشدی برای این قارچ از ۲۰-۲۲ درجه سانتی گراد برای جدایه هایغیربرگریز تا ۲۷-۲۸ درجه سانتی گراد برای جدایههای برگریز میباشد (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ عطار، ۱۳۸۵؛ Sanei et al., 2004). البته رشد جدایهای از این قارچ در دمای ۳۶ درجه سانتی گراد نیز گزارش شده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳). عراقی و همکاران (۱۳۸۹) نشان داد که در مورد جدایههای V. dahliae بهینه دمای رشدی و تولید میکرواسکلروت برای جدا شدههای پنبه، به ترتیب ۲۵ و ۲۷ و برای دو جدا شده از زیتون و بادام ۲۲ درجه سانتی گراد (هم برای رشد وهم تولید میکرواسکلروت) میباشد. جدایههای با بیماریزایی بیشتر (مهاجم و برگریز) در دماهای بالاتر، رشد بهتری را از خود نشان می دهند. نتایج مشابهی توسط محققین دیگر گزارش گردید (حمداله زاده، ۱۳۷۲؛ صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ Sanei et al., 2004).
نتایج بررسی اثر دما روی ۸ جدایه زیتون و ۶ جدایه پنبه از باغات و مزارع مختلف استان گلستان نشان داد که الگوی رشدی براساس نوع جدایه و میزان درجه حرارت متفاوت بوده است. بهینه دمای رشدی برای جدایههای مختلف زیتون ۲۳ یا ۲۵ و برای جدایههای مختلف پنبه ۲۳، ۲۵ تا ۲۷ درجه سانتی گراد گزارش گردید. مقایسه توان رشدی و بیماریزایی جدایهها نشان داد که جدایههای مهاجم تر بیشترین رشد را در ۲۷ درجه سانتی گراد داشتند (عطار، ۱۳۸۵). از اینرو به نظر میرسد که توانایی رشد و تولید میکرواسکلروت توسط جدایههای ورتیسیلیوم به طیف دما بستگی داشته که یکی از مهمترین عامل گسترش اکولوژیکی و بیماریزایی این قارچ باشد.
دامنه حرارتی جوانه زدن اسپورهای V. dahliae حدود ۲۴-۳۰ درجه سانتی گراد گزارش شده است. بهعلاوه بنظر میرسد که اسپورهای سوش برگریز برخلاف سوش غیر برگریز در دمای ۳۳ درجه سانتی گراد نیز قادر به جوانه زدن میباشند. نقطه مرگ این قارچ در خاک حدود ۳۰ دقیقه در دمای ۵/۵۷ درجه سانتی گراد گزارش شده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳؛ Bollen, 1985).
۲-۲-۴- ۲-۲- اسیدیته[۶]
رشد این قارچ در اسیدیته بین ۵ تا ۷ بهخوبی انجام گرفته و در صورت کاهش اسیدیته به ۳ یا کمتر، رشد قارچ به شدت کاهش مییابد. این گونه اسیدیته بالاتر از ۷ )۸-۶/۸( را راحتتر تحمل می کند. رشد قارچهای عامل پژمردگی ورتیسیلیومی بر روی محیطهای کشت، با تغییر اسیدیته محیط همراه است. البته میزان تغییر به منابع کربن و ازت موجود در محیط بستگی دارد. این تغییر اسیدیته در ضمن رشد قارچ می تواند رشد بعدی عامل بیماری را تحت تاثیر قرار دهد. در این ارتباط، رشد ضعیف گونه های ورتیسیلیوم بر روی محیطهای غیر بافری شامل نمکهای آلومینیوم یا منابع ازت آلی گزارش شده است. اضافه نمودن کربنات کلسیم به محیطهای کشت با افزایش رشد قارچ همراه است (صانعی وهمکاران، ۱۳۸۳؛ Puhalla and bell, 1981).
اسیدیته بندرت جوانه زدن اسپورهای این قارچ نیز را نیز محدود می کند بطوری که اسپورها در دامنه وسیعی از اسیدیته (۴-۹) جوانه میزنند. اما اسیدیتههای پایین بقاء میکرواسکلروتها را در خاک کاهش میدهد (صفری عربی و همکاران، ۱۳۷۶).
۲-۲-۴- ۲-۳ - نور
میکرواسکلروتها در جدایه V. dahliae هم در شرایط نور و هم در تاریکی تولید میشوند. نور مداوم احتمالاً اسپورزایی قارچ را تحریک می کند. البته در یک جدایه اثر نور مداوم با کاهش میزان میکرواسکلروت همراه بوده است (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳).
مطالعات مربوط به کیفیت نور بر عوامل پژمردگی ورتیسیلیومی نشان داد که نور سبز رشد V. dahliae کم و نور قرمز تولید میکرواسکلروت را افزایش میدهد. همچنین تولید زهرابه و لیپو-پلی ساکارید در جدایههای این قارچ که تحت نور قرمز رشد کرده، کاهش یافته و تلقیح این قارچها به گیاه پنبه با کاهش میزان آلودگی همراه است (Akhmedzhanov et al., 1990). نور آبی تولید اسپور را در این قارچ افزایش داده، اما از تولید میکرواسکلروت بطور کامل جلوگیری می کند. بررسیهای هوشیارفرد و همکاران (۱۳۷۹) نشان داد که نور ماورای بنفش شدت بیماریزایی جدایههای V. dahliae را تحت تاثیر قرار میدهد و موجب القاء بطئیتر علایم بیماری در گیاه میگردد.
۲-۲-۴-۳- ژنتیک
۲-۲-۴-۳-۱- گروه های سازگار رویشی[۷]
سازگار رویشی به قابلیت افراد یک استرین برای انجام آناستموز و ایجاد هترکاریونهای پایدار گفته می شود. با ایجاد هتروکاریون، جدایههای مورد نظر در یک گروه سازگار رویشی قرار میگیرند. سازگاری رویشی همانند سازگاری جنسی توسط یک یا چند محل ژنی کنترل می شود. در سادهترین سیستمها، استرینهایی که دارای یکسری محلهای ژنی مشابهاند، قادر به تشکیل هتروکاریون پایدار خواهند بود (Elena, 2000).
پاپایوآنو و همکاران (Papaioannou et al., 2013) با بهره گرفتن از ناحیه IGS ریبوزومی (ribosomal intergenic spacer) تمایز مولکولی و آنالیز فیلوژنتیکی گروه های سازگار رویشی قارچ V. dahliae را مورد بررسی قرار دادند. آنها با مقایسه ۲۰۱ توالی موجود در بانکهای اطلاعاتی، یک زیرناحیه متغیر (حاوی چهار گروه متفاوت از توالیهای تکراری) در این ناحیه IGS را ردیابی کردند. این زیرناحیه برای یک کلکسیون بین المللی از ۵۹ جدایه متعلق به همه VCGهای V. dahliae و ۹ نماینده از V. albo-atrum و V. longisporum تکثیر و تعیین توالی شد. آنالیزهای فیلوژنتیکی این زیرناحیه پلیمورفیک، تشخیص دو دودمان اصلی در V. dahliae (یکی شامل گروه های سازگار رویشی ۱A، ۱B، ۲A، ۴B و ۳ و دیگری شامل گروه های ۲B، ۴A و ۶) را امکان پذیر ساخت. آنالیز توالیهای این ناحیه، مناسب بودن آن به عنوان یک ابزار مولکولی برای تمایز سریع بین گونه ای، تفکیک درون گونه ای بین گروه های سازگار رویشی V. dahliae و آنالیز فیلوژنتیکی درون و بین گروه های سازگار رویشی V. dahliae را ثابت نمود.
یک روش PCR آشیانهای مرکب[۸] برای ردیابی V. dahliae در داخل گیاه کنگرفرنگی و تشخیص گروه های سازگار رویشی آن ابداع شد. گروه های سازگار رویشی در داخل بافت گیاه بر اساس الگوهای خاص مارکرهای مولکولی تکثیر شده، از یکدیگر تشخیص داده شدند. همچنین این روش در مقایسه با روشهای سنتی دارای حساسیت بسیار بالاتری در ردیابی پاتوژن حتی در گیاهان بدون علایم بود ((Collado-Romero et al., 2009).
در یونان ۲۳ جدایه V. dahliae بدست آمده از پنبه همراه با جدایههایی از گوجه فرنگی و هندوانه در گروه VCG2 قرار گرفتند. دو جدایه از گوجه فرنگی در VCG4 و ۹ جدایه فاقد هرگونه مکمل به جدایههای استاندارد بودند (Ebihara et al., 1997). در مطالعات بعدی ۴۴ جدایه از این قارچ از میزبانهای مختلف در سه گروه VCG2A,B (17 جدایه)، VCG3 (2 جدایه) و VCG4A,B (8 جدایه) قرار گرفتند. در این بررسی ۱۷ جدایه در ارتباط با VCGهای شناخته شده نبودند (Gennari et al., 1997).ریگز و گراهام (Riggs and Graham, 1995) از امریکا دریافتند که جدایههای V. dahliae از پنبه در VCG1، جدایههای فلفل و پسته در VCG2 و جدایههای گوجه فرنگی در VCG3 قرار میگیرند.
جهت مشخص شدن گروه های سازگار رویشی در ورتیسیلیوم در مطالعات سنتی از آگزوتروفها، جهش یافتههای سفید و قهوهای و جهش یافتههای nit استفاده می شود. اکثر گروه های سازگار پیشنهاد شده برای عوامل پژمردگی، با بهره گرفتن از جهش یافتههای nit مشخص شده اند. مطالعات نراقی و همکاران (۱۳۷۹) یازده گروه سازگار رویشی را در جدایههای پنبه با بهره گرفتن از جهش یافتههای آگزوتروف مشخص نمود. بررسی گروه های سازگار رویشی در جدایههای ایرانی V. dahliae نیز صورت گرفته است. در این مطالعه ۸ گروه سازگار رویشی شامل یک گروه برگریز و ۷ گروه غیر برگریز مشخص شد (عرب سلمانی و بنی هاشمی، ۱۳۷۹).
۲-۲-۴-۳-۲- استرین، پاتوتیپ و نژاد
به دنبال یافتههایی مبنی بر وجود جمعیتهای V. dahliae با بیماریزاییهای مختلف، دو استرین با بیماریزایی شدید (برگریز، T1 ، T9 یا P1) و بیماریزایی کمتر (غیر برگریز، SS4 یا P2) در جدایههای عامل بیماری پژمردگی ورتیسیلیومی پنبه پیشنهاد شد. مسئله اصلی در رابطه با تعیین استرین، نژاد یا پاتوتیپ و ارقام در جدایههای V. dahliae بدست آمده از گیاه پنبه به پیچیدگی ژنتیک گونه ها و ارقام پنبه مربوط است. مطالعات نشان میدهد که اثر محیط بر روی همکنش پاتوتیپهای V. dahlia پنبه کاملاً موثر است (Joaquim and Row, 1990).
علائم تشخیص این دو پاتوتیپ وجود ریزش برگها در ارقام مختلف پنبه میباشند. هر دو فرم این بیماری نیز در استانهای گلستان و فارس روی پنبه شیوع داشته و خساراتی را هر ساله وارد مینماید (عرب سلمانی و همکاران، ۱۳۸۳). در بررسی ۶۳۷ جدایه از ۴۳۳ درخت در ۶۵ باغ از ۵ ناحیه زیتون کاری در منطقه اندولوزیا اسپانیا مشخص گردید که اگرچه جدایههایی مربوط به هر دو گروه سازگار رویشی (A و B) و هر دو پاتوتیپ برگریز و غیر برگریز وجود داشت، اما اغلب جدایهها مربوط به گروه سازگار رویشی A و پاتوتیپ برگریز بودند (Jiménez-Díaz et al., 2011).
تنوع ژنتیکی بین سه جدایه V. dahliae با بهره گرفتن از مارکر مولکولی چندشکلی DNA تکثیر شده تصادفی (RAPD) بررسی گردید و اختلاف مولکولی بین آنها، تفاوتها و شباهتهای مرفولوژیکی را تایید نمود (Alshalchi et al., 2008). در بررسی تنوع ژنتیکی ۹۹ جدایه این قارچ با بهره گرفتن از مارکر مولکولی RAPD، مشخص شدکه تنوع ژنتیکی معنیداری بین جمعیت ورتیسیلیوم وجود داشته و با بهره گرفتن از تکنیک کلاستر، این ۹۹ جدایه به ۱۵ گروه تقسیم شدند (Zhu et al., 1999). زائو و همکاران (Zhou et al., 1999) نیز در چین ۳۷۹ باند RAPD را در بین جدایههای قارچ ورتیسیلیوم گزارش نمودند. تکنیک ژنتیک مولکولی برای تشخیص و طبقه بندی استرینهای پاتوژن پژمردگی ورتیسلیومی در استرالیا نیز مورد استفاده قرار گرفت، اما الگوی باندهای RAPD همبستگی قوی بین صفات بیماریزایی و ژنتیک مولکولی را نشان نداد (Ramsay, 1996).
۲-۲-۴-۳-۳-جنبه های مولکولی تشخیص
بررسی ژنتیک مولکولی در عوامل پژمردگی ورتیسیلیومی، اولین بار در سال ۱۹۹۰ در پنجمین همایش بین المللی ورتیسیلیوم گزارش گردید. پس از آن مطالعات متعدد مولکولی در رابطه با گونه های مختلف، استرینها و پاتوتیپهای عامل پژمردگی صورت گرفت. از این بررسیها میتوان به استفاده از اندونوکلئازهای محدود کننده برای برش کل ژنوم و بررسی قطعات بدست آمده بر روی ژل الکتروفورز بر اساس وزن مولکولی اشاره نمود (Perez-Artes et al., 1997). همچنین تفاوتهای ژنتیکی در جدایهها با بهره گرفتن از الگوهای پلیمورفیسم در رابطه با DNA ریبوزومی و میتوکندریایی در گونه های مختلف ورتیسیلیوم مورد مقایسه قرار گرفت (Koike et al., 1995; Perez-Artes et al., 1997).
بررسیها نشان داد پاتوتیپهای V. dahliae بدست آمده از پنبه را میتوان از طریق RAPD تشخیص داد. در این رابطه با بهره گرفتن از سه آغازگر، باندهای مشخصی برای تشخیص گروه های برگریز و غیر برگریز ارائه شد (Perez-Artes et al., 1997). بررسیهای هریس و یانگ ۱۹۹۵) (Harris and Yong, نیز ارتباط مشخصی بین برخی از گروه های VCG و گروه های RFLP در ۴۳ جدایه از V. dahliae از انگلستان را نشان داد. اما میانگین بیماریزایی برای هر گروه RFLP/VCG متفاوت بوده است. همچنین گروه های بدست آمده با منشاء میزبانی جدایه مرتبط نبودند.
زارع (۱۳۸۲) روشهای مولکولی جهت ارزیابی معیارهای تاکسونومیکی ورتیسیلیومهای مرتبط با گیاهان را مورد استفاده قرار داد. سی و یک استرین ورتیسیلیوم به وسیله مقایسه ITS-RELPs به چهار کلاستر تقسیم شدند. کلاستر اول در برگیرنده استرینهای گونه تیپ V. luteo-album (Link: Fries) Subramanian، کلاستر دوم شامل V. dahliae klebahn, V. albo-atrum Reinke & Berthold، V. nubihni pethybridge و V. tricorpus Isaac؛ کلاستر سوم شامل V. theobromae (Turconi) E. Mason & S. Hughes و کلاستر چهارم شامل V. nigrescens pethybridge بود. در این تحقیق الگوهای RFLP به دست آمده از ژن بتا توبولین(β-tubulin gene) حتی قدرت تفکیک بالاتری داشته و هر هفت گونه مورد آزمایش را از یکدیگر تشخیص دادند. بالاترین قدرت تفکیک از الگوهای RFLP حاصل از DNA میتـوکندریایی (mitochondrial DNA-RFLPs) به دست آمد، به طوری که این روش استرینهای گونه های V. theobromae و V. nigrescens را در سطح فراگونهای از یکدیگر تفکیک نمود. در نهایت مشخص گردید که برش ژن بتا-توبولین توسط آنزیم برش دهنده HaeIII و مقایسه الگوهای به دست آمده روشی قابل اعتماد برای تفکیک دو گونه مهم اقتصادی و بحث برانگیز V. albo-atrum و V. dahliae میباشد.
یک روش سریع، کارآمد و دقیق جهت شناسایی و تعیین جمعیت V. dahliae در سیب زمینی براساس تکثیر ژن تریپسین پروتئاز با بهره گرفتن از واکنش زنجیرهای پلیمراز کمی توسط پاچه و همکاران et al., 2013) (Pasche ابداع گردیده که بسیار بهتر از روشهای سنتی (کشت بافتهای آلوده و یا شیرابه ساقه سیبزمینی روی محیطهای نیمه انتخابی) و نیز روشهای مدرن قبلی (تعیین جمعیت از طریق تکثیر ژن β-tubulin که با بهره گرفتن از QPCR جهت ارزیابی ارقام مقاوم سیب زمینی (بر اساس میزان آلودگی ساقهها به قارچ عامل بیماری) انجام میگرفته، بود. این روش جدید دارای حساسیتی بالا (۲۵/۰ پیکوگرم DNA) بود. به کمک این روش جدید، پاتوژن عامل بیماری را میتوان با فراوانی بهمراتب بالاتر از روشهای سنتی و حتی مدرن قبلی در بافتهای سیبزمینی ردیابی و شناسایی نمود.
۲-۲-۴-۳-۴-میزبانها
۲-۲-۴-۳-۴-۱- میزبانهای ورتیسیلیوم در جهان
قارچ ورتیسیلیوم دامنه وسیعی شامل ۲۰۰ گونه متعلق به ۴۰ خانواده از گیاهان زراعی، صنعتی، سبزیجات و درختان میوه و سایهدار را مورد حمله قرار میدهد (Agrios, 2005).
خانوادههای مختلف گیاهی که توسط عوامل پژمردگی ورتیسیلیومی مورد حمله قرار میگیرند در جدول ۲-۱ ارائه گردید (صانعی و همکاران، ۱۳۸۳).
جدول ۲-۱- تعداد گونه ها در خانوادههای مختلف گیاهی که توسط عوامل پژمردگی ورتیسیلیومی مورد حمله قرار میگیرند.
موضوعات: بدون موضوع
[ 05:23:00 ق.ظ ]