به منظور کاهش غلظت بافر نمکی و حذف ایمیدازول از محیط پروتئین ،جهت نگهداری طولانی مدت ،پروتئین تخلیص شده علیه بافر نمکی با غلظت کم دیالیز و سپس تغلیظ شد.
مواد و وسایل مورد نیاز:
EDTA (5mM)(برای ۱۰۰ میلی لیتر)

به این منظور ۱ml از استوک EDTA با غلظت o.5 M ، با آب مقطر به حجم ۱۰۰ml رسید.
بافر دیالیز PH=8 (برای ۵ لیتر)
PBS(1x)
*این بافر باید کاملا سرد باشد، لذا قبل از استفاده در یخچال قرار می گیرد.
۳- کیسه دیالیز (sigma)(برای ۱۰ میلی لیتر محلول)
به این منظور حدود ۱۰ سانتی متر از کیسه (با ابعاد ۱۰×۶mm)با احتیاط بریده شد.
*از آنجا که میکروارگانیسم های پوست می توانند باعث سوراخ شدن کیسه گردند لذا در هنگام کار از دستکش استفاده می شود.
۴- PEG (polyethylene glycol)
۵-گلیسرول ۹۹درصد (sigma)
ارلن
گیره
انکوباتور با دمای ۶-۴ درجه سانتی گراد
روش کار:
- محلول EDTA (5mM) در یک ارلن متوسط ریخته شد و به منظور جوشاندن حرارت دید.
پس از رسیدن محلول فوق به حالت جوش ، کیسه دیالیز بریده شده به آرامی داخل ارلن قرار گرفت و به مدت ۵ دقیقه در این محلول جوشانده شد.
کیسه دیالیز از محلول خارج گردید و چند ین بار با PBS(1x) شسته شد.
فراکشن های حاصل از مرحله تخلیص مورد هدف برای دیالیز در داخل کیسه دیالیز ریخته شد، سپس دو انتهای آن را با گیره مسدود کردیم و به صورت آویخته در ارلن حاوی دو لیتر بافر PBS(1x) به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۴-۶ درجه سانتی گراد با شیک بسیار آرام غوطه ور گردید. نکته مهم در این مرحله یکسانی PH بافر دیالیز با بافرهای تخلیص (در اینجاPH=8 ) است. در این مرحله تبادل بافری صورت می گیرد.
جهت تغلیظ، کیسه دیالیز از بافر خارج شد و در PEG جامد مدفون گردید، سپس در یخچال قرار گرفت. در این حال سرد بودن محیط جهت حفظ ساختار پروتئین الزامی است. از آنجا که در این مرحله جذب آب و برخی نمکها صورت می گیرد ، لذا جهت جلوگیری از تغلیظ بیش از حد، میزان حجم هر ۳۰ دقیقه کنترل شد.
پس از آنکه حجم بافر حاوی پروتئین به حدود یک دهم حجم اولیه کاهش یافت، نمونه از کیسه خارج شد و پس از افزودن ۵۰ درصد گلیسرول در ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
*مجاورت با بافر دیالیز باعث کاهش غلظت نمکها (برای مثال ایمیدازول ۵۰۰mM) می گردد.
*مجاورت با PEG باعث حذف آب و تغلیظ پروتئین می گردد. در این حال مقداری از نمک ها نیز خارج می گردد.
*جهت موثر بودن تبادل بافری می توان مرحله ۴ را مجددا تکرار کرد و حتی زمان آن را به یک شب افزایش داد.

۳-۲۲- ارزیابی پروتئین تخلیص شده

برای ارزیابی پروتئین تخلیص شده از روشSDS-PAGE وتست برادفورد و اسپکتروفوتومتری بهره گرفته شد. پروتئین‌ها در طول موج ۲۸۰ نانومتر جذب دارند بنایراین جذب نوری با این طول موج برای محلول پروتئین ما خوانده شد.

۳-۲۳- روش برادفورد

این روش نسبت به روش های دیگر حساس تر ،سریع تر ، ساده تر و دقیق تر است و برای اندازه گیری پروتئین تا حد میکروگرم به کار می رود.از مزایای دیگر این روش آن است که عوامل مداخله کننده در این روش کمتر از روش های دیگر است. در حالی که در روش بیوره مقادیر کم تریس، آمونیاک و گلیسرول و در روش لوری پتاسیم، منیزیم،EDTA، تریس، تیول دار و کربوهیدرات مزاحمت نشان می دهند. این روش براساس اندازه گیری پروتئین و پپتید به کمک ماده رنگ زای کوماسی بریلیانت جی ۲۵۰ صورت می گیرد که با کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر با نور مرئی قابل خواندن است. ماکزیمم جذب نوری معرف رنگی از ۴۶۵nm قبل از ترکیب پروتئین به ۵۹۵nm بعد از ترکیب تغییر می کند.

۳-۲۳-۱- طرز تهیه محلول های مورد نیاز

۳-۲۳-۲- طرز تهیه محلول برادفورد

۵۰mg کوماسی بریلیانت بلو G-250(Sigma) در ۲۵ml اتانول مطلق (Merk آلمان) حل شد، ۵۰ml اسید فسفریک ۸۵ درصد (MerK آلمان) به آن اضافه شد و حجم نهایی با آب با آب دو بار تقطیر شده به ۵۰۰ML رسانده شد. سپس محلول از کاغذ واتمن عبور داده شد( این محلول در دمای ۵-۰ درجه تا یک ماه پایدار است).تا زمان استفاده در فریزر ۲۰-درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

۳-۲۳-۳- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت ۱۰۰۰mg/ml

۱۰ mg سرم گاوی BSA (Sigma) فراکشن پنج در ۱۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد و استاندارد ذخیره ۱mg/ml ساخته شد. این محلول تا زمان استفاده در فریزر ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شد.

۳-۲۳-۴- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین با غلظت ۱۰,۱۰۰mg/ml

مقدار یک میلی لیتر از استاندارد ذخیره شده برداشته شده و به حجم ۱۰ میلی لیتر رسانده شد.این محلول به صورت روزانه و تازه تهیه شد.

روش کار:
از پلیت ۹۶ تایی برای برادفورد استفاده شد.
مقدار ۲۰۰µl بافر برادفورد در همه خانه ها ریخته شد.
۱۰ لاندا از نمونه ها و استانداردها به خانه ها اضافه شد و به صورت کامل با بافر برادفورد مخلوط شد.
اندازه گیری پروتئین در محلول هاای با غلظت پروتئین ۱ mg/ml تا ۰٫۰۱
نمونه های استاندارد در محلول های مجهول به صورت دوتایی باشد
۱۰µl از نمونه ضافه گردید.
بعد از گذشت ۱۵ دقیقه از روشن کردن دستگاه اسپکتروفوتومتر جذب نمونه ها در ۵۹۵nm خوانده شد
منحنی استاندارد با بهره گرفتن از OD های به دست آمده از استانداردها رسم شد.
در صورت غلیظ بودن نمونه فرایند برادفورد برای نمونه های غلیظ با رقیق کردن نمونه تکرار شد.

۳-۲۴- بررسی خلوص پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با روش SDS-PAGE

کلیه فراکشن های حاصل از مراحل مختلف تخلیص و بهینه سازی تخلیص پروتئین HPV مطابق دستور کار قسمت قبلی بر روی ژل SDS-PAGE بررسی شد.پس از رنگ آمیزی با کوماسی بلو و نیترات نقره، تایید پروتئین مورد نظر از روی تطابق باندها شاخص وزن ملکولی صورت گرفت.

۳-۲۵-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات

پس از SDS-PAGE کلیه فراکشن های تخلیصی و رنگ آمیزی ژل فراکشن تاییدی حاوی باند مورد نظر انتخاب شد و وسترن بلات برای تایید نهایی بر روی نمونه مذکور انجام گرفت.به این منظور وجود باند پروتئینی HPV از طریق بلاتینگ با آنتی بادی علیه اپی توپ های HPV و دنباله هیستیدینی تایید شد و هویت آنتی ژنی آن با بلاتینگ با آنتی بادی ضد هیستیدین در برابر نمونه های کنترل بررسی شد.انتخاب غلظت آنتی بادی های به کار رفته با تغییر شرایط بلاتینگ و ایجاد شرایط بهینه جهت کسب نتایج بهتر صورت گرفت.

۳-۲۶-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی