اعتمادی و همکاران(۱۳۸۷)، عصاره رزماری را به عنوان آنتی اکسیدان و آنتی باکتریال طبیعی برای افزایش عمرماندگاری ماهی قزل آلای رنگین کمان^[۱۲۰] استفاده کردند، و نتیجه گرفتند که این عصاره گیاهی باعث تأخیر در فساد ماهی شده بطوریکه تعداد باکتری های سرمادوست و باکتری های اسیدلاکتیک و انتروباکتریاسه را بطور معنی داری کاهش داد و در مورد فساد شیمیایی هم باعث کاهش معنی داری در تری متیل آمین^[۱۲۱]، اسیدهای چرب آزاد^[۱۲۲]، پراکساید^[۱۲۳]، تیوباربیتوریک اسید^[۱۲۴] شده و ماهی های تیمار شده از نظر حسی هم دارای امتیاز بالاتری نسبت به ماهی های کنترل بودند.

قزل آلای رنگین کمان مانند سایر گونه های ماهیان چرب به طور ویژه ای به تغییرات اکسیداسیون و فساد کیفی طی مدت نگهداری حساسند. با توجه به تغییرات کیفی ماهیان در هنگام نگهداری به روش سرد و مشکلات استفاده از نگهدارنده های مصنوعی، کاربرد نگهدارنده های طبیعی در حفظ کیفیت و افزایش ماندگاری ضرورت مییابد. در این راستا نظر به فراوانی تولید و عرضه ماهی قزل آلای رنگین کمان در کشور، این ماهی به عنوان گونه مورد مطالعه انتخاب شده است و اثرات عصاره چای سبز در ترکیب با پلی آمید در نگهداری این ماهی مورد ارزیابی قرار گرفت.
فصل سوم
مواد و روش­ها
۳- مواد و روش کار
۳-۱ مواد و وسایل مورد استفاده
۳-۱-۱ مواد مصرفی
ماهی قزل آلای رنگین کمان،برگ خشک چای سبز،کلرید کلسیم،پلی آمید۶ ، تیوسولفات سدیم، متانول، کلروفرم، سود، اتانول، اسید استیک،۱- بوتانل،معرف TBA ،معرف فنل فتالئین،معرف متیل قرمز، معرف نشاسته، اکسید منیزیم، اسید بوریک، ، اسید سولفوریک،کاغذ صافی بدون خاکستر واتمن ۴۲ ، فویل آلومینیومی، آب مقطر، محیط کشت پلیت کانت آگار (PCA)، محیط کشت ویولت رد بایل گلوکز آگار(VRBGA) .مواد شیمیایی از شرکت مرک و حلالها از شرکت دکتر مجللی تهیه شد و چای سبز محصول شرکت طلا و پلی آمید۶ از شرکت (Eurotec) نیوزلند میباشد.
۳-۱-۲ مواد غیر مصرفی
شیشه آلات آزمایشگاهی نظیر ارلن، استوانه مدرج، بشر، قیف، لوله های آزمایش ساده و درب دار، شیشه ساعت، پیپت، همزن شیشه ای، دکانتورهای ۲۵۰ و ۵۰۰ میلی لیتری از شرکت PYREX، ترازوی با دقت یک ده هزارم( A&D-HR-200-ژاپن) ، آون (بهداد،ایران) ، هم زن مگنتی (Heidolph, MR300 K ، آلمان) دسیکاتور، بن ماری ، هیتر ، اسپکتروفتومتر ، دستگاه کجلدال اتوماتیک مدلVAP20S شرکت GERHARDT آلمان، دماسنج جیوه ای، سبدهای پلاستیکی، پتری دیش یکبار مصرف، های اتوکلاو، سرنگ های میکرولیتری، انکوباترهای Co 35، ۳۰، ۱۰^[۱۲۵]. بوته چینی، همزن برقی، پیپت پاستور، هود، شعله، لگن پلاستیکی، آسیاب الکتریکی (Nowake،ژاپن).

۳-۲ روش کار
۳-۲-۱ تولید فیلم و عصاره
۳-۲-۱-۱ روش تهیه عصاره متانولی چای سبز ^[۱۲۶]
جهت تولید عصاره متانولی چای سبز از روش چن^[۱۲۷] با کمی تغییرات استفاده شد.ابتدا چای سبز از مجموعه هایپر استار تهران با برند طلا خریداری شد،سپس چای سبز به وسیله آسیاب الکتریکی به طور کامل پودر شد و با نسبت ۱۰ گرم پودر چای سبز و ۱۰۰ میلی لیتر متانول در ظرف ظرف شیشه ای درب دار که به وسیله فویل آلومینیوم از نور محافظت می شود بر روی هات پلیت بدون گرما به مدت ۲۴ساعت با دور ۷۵۰ دور بر دقیقه،هات پلیت همزده شد. سپس محلول بدست آمده به وسیله کاغذ صافی صاف شده و محلول زیر صافی در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری می شود.
۳-۲-۱-۲ روش تهیه فیلم بسته بندی پلی آمید۶
جهت تولید این فیلم ابتدا مقدار ۱۴ میلی لیتر متانول با دانسیته ۰٫۷۹گرم بر سانتی متر مکعب را با ۲٫۸ گرم کلرید کلسیم خشک که به وسیله ترازوی دیجیتال ۰٫۰۰۰۱(با دقت۰٫۱میلی گرم ،ساخت ژاپن)توزین شد ودرآون با دمای ۱۰۵ درجه سانتی گراد به مدت ۲۰ دقیقه کاملاً خشک و بدون رطوبت شده بود را به داخل ظرف شیشه ای درب دار تولید فیلم ریخته، بدون اعمال حرارت در دور ۳۰۰ هات پلیت،محلول نیمه شفاف متانول اشباع از کلرید کلسیم را در مدت ۲۰ دقیقه تهیه کرده، سپس مقدار ۱٫۴ گرم پلی آمید ۶ که آن هم به وسیله ترازوی دیجیتال ۰٫۰۰۰۱(با دقت۰٫۱میلی گرم ،ساخت ژاپن)توزین شد و در دمای ۱۰۵ درجه سانتی گراد آون کاملاً خشک و بدون رطوبت شده بود به محلول فوق افزوده شد.این محلول به مدت ۲۱ ساعت با دور ۳۰۰ هات پلیت چرخید و محلولی با غلظت بالا تهیه شد.پس از آن در جهت کاهش غلظت و بهتر شدن خصوصیات فیلم به آن ۱۴ میلی لیتر متانول با دانسیته ۰٫۷۹گرم بر سانتی متر مکعب افزوده شد و محلول بازهم با شرایط قبل به مدت ۳ ساعت چرخیده شد و در همین زمان بر حسب درصد میزان چای سبز در فیلم تولیدی عصاره متانولی چای سبز به محلول اضافه میشود. پس از آن ۲۸ میلی لیتر از محلول ساخته شده را بر روی پلیت های مخصوص کاستینگ با مساحت۲۵۶ سانتی متر مربع،ریخته و پس از ۱۲ ساعت نگهداری در دمای آزمایشگاه متانول حذف شده و فیلم هااز سطح پلیت جدا شدند.
۳-۲-۲ آماده سازی و بسته بندی نمونه های ماهی
۳۶ عدد ماهی قزل آلای رنگین کمان با میانگین وزن ۳۵۰ گرم، میانگین طول ۲۸ سانتیمتر از یکی از مزارع پرورشی واقع در دیباج – دامغان تهیه شد. نمونه ها از بین ماهی های هم اندازه و سالم، بطور
تصادفی انتخاب شدند و پس از صید ماهی ها در بهار ۱۳۹۲ از مزرعه برداشت شده و در مدت ۶۰دقیقه به آزمایشگاه دانشگاه منتقل شدند. ماهی ها را با آب شسته و پس از تخلیه شکمی دوباره شسته شدند. اقدام به تهیه فیله گردید و از هر ماهی دو فیله در اندازه­ های ۵ ×۱۲ تهیه گردید. عمل بسته بندی در زیر هود میکروبی انجام شد.فیلمهای بسته بندی از قبل با پنبه آغشته به الکل استریل شدند. فیله ها به ۶ قسمت تقسیم شدند برای بسته بندی در لفاف ها با ۶ غلظت متفاوت ۰ و ۲٫۵ و ۵ و ۱۰ و ۲۰ و۴۰٫ و در هر بسته ۱فیله توسط دستگاه دوخت حرارتی بسته بندی شد.

۳-۲-۳ آنالیز تقریبی
۳-۲-۳-۱ سنجش درصد رطوبت
برای درصد رطوبت، ابتدا ظروف شیشه ساعت، پس از خشک شدن در آون در دسیکاتور سرد شده و توزین شدند. سپس چند گرم نمونه توزین و داخل آن قرار داده شد و وزن ظرف و نمونه ثبت گردید. بعد از آن ظروف همراه با نمونه در آون دمای ۱۰۵ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفتند. پس از ۲۴ ساعت پتری دیش ها همراه با نمونه از آون خارج و در دسیکاتور سرد شده و مجدداً وزن شدند. با محاسبه اختلاف وزن به دست آمده درصد رطوبت مشخص گردید.^[۱۲۸]
۱۰۰×(وزن اولیه/ وزن نهایی- وزن اولیه)= درصد رطوبت
۳-۲-۳-۲ سنجش درصد خاکستر
برای تعیین میزان درصد خاکستر نمونه ها، از کوره الکتریکی استفاده شد. ابتدا بوته های چینی خالی در آون با دمای ۱۹۰ درجه سانتی گراد به مدت ۶۰ دقیقه قرار داده شدند و پس از سرد شدن در دسیکاتور توزین گشتند ۵/۰ گرم از نمونه که قبلاً در آون با دمای ۶۵ درجه سانتی گراد به مدت ۴۸ ساعت قرار گرفته بودند، در بوته های چینی ریخته شد و سپس وزن بوته ها همراه با نمونه اندازه گیری شد، نمونه ها در کوره با دمای ۵۵۰ درجه سانتی گراد به مدت ۵ ساعت سوزانده شد. نمونه ها پس از سوزانده شدن به مدت ۳۰ دقیقه درون دسیکاتور سرد شدند و سپس با ترازوی دیجیتالی با دقت ۰۰۱/۰ گرم وزن شدند و سپس درصد خاکستر نمونه ها از طریق فرمول زیر محاسبه گردید.^[۱۲۹]
۱۰۰×(وزن نمونه/ وزن بوته چینی- وزن بوته همراه با نمونه نهایی)= درصد خاکستر
۳-۲-۳-۳ سنجش درصد پروتئین
پروتئین نمونه ها به روش کلدال، مورد تجزیه قرار گرفتند. برای تعیین درصد پروتئین موجود در نمونه ها، یک گرم از نمونه را روی کاغذ صافی وزن می‌کنیم و بعد ۸ گرم کاتالیزور (۳گرم دی اکسید سلنیوم، ۱۶ گرم سولفات مس، ۴۰۰ گرم سولفات پتاسیم خشک) به آن اضافه میکنیم.سولفات مس و دی ‌اکسید سلنیوم باعث افزایش سرعت واکنش می‌شوند. سولفات مس بعنوان معرف عمل می‌کند و عامل ایجاد رنگ سبز پس از حرارت است. کاغذ صافی را تا کرده و داخل بالن کلدال می‌اندازیم.۲۰ میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ به بالن اضافه می‌کنیم.قسمت گازگیر را روی آن قرار می‌دهیم به طوریکه دو لوله داخل قسمت حبابی آن به موازات هم قرار گیرد. در هرسری کار با دستگاه ۲ لوله به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. حمام هضم دستگاه قبلا” روشن، و پس از قرار دادن لوله ها در دستگاه مورد نظر، دمای کوره به تدریج به مورد نظر هضم رسانده شد تا هضم صورت گیرد. در هنگام هضم، نمونه ها ابتدا به رنگ قهوهای و سپس به رنگ سبز شفاف در آمدند و در مرحله آخر تقریبا” به رنگ آبی شفاف، که نشانه هضم کامل بود، درآمدند. این مراحل حدو ۱٫۴۰ دقیقه به طول می انجامد. پس از هضم نمونه ها و سرد شدن آنها ۵۰میلی لیتر آب مقطر به هر لوله اضافه شد.لوله ها را در دستگاه تقطیر قرار داده میشود، در یک ارلن ۵۰ میلی لیتر اسید بوریک ۲ درصد و چند قطره معرف کلدال ( متیل قرمز و برموکروزول گرین) و زیر لوله تقطیر قرار میدهیم ، بعد از عمل تقطیر که ۴ دقیقه به طول می انجامید.ارلن را از دستگاه خارج کرده و محتویات داخل ارلن را بوسیله اسید سولفوریک ۰٫۱ نرمال تیتر ، تا ظهور رنگ اولیه معرف تیتر گردید. سپس بر اساس میزان اسید مصرفی در تیتراسیون درصد پروتئین نمونه ها از طریق فرمول زیر محاسبه گردید.

V_S = حجم اسید کلریدریک مصرف شده برای نمونه.
N= نرمالیته اسید.
V_B= حجم اسید کلریدریک مصرف شده شاهد.
W= وزن نمونه.
۳-۲-۳-۴ سنجش درصد چربی
اندازه گیری درصد چربی با روش کلروفرم- متانول انجام شد(بلینگ و دیر، ۱۹۵۹)^[۱۳۰] ابتدا مقدار ۱۵ گرم نمونه را وزن کرده و همراه ۶۰سی سی متانول در دکانتور ریخته و به خوبی هموژن می شود. سپس مقدار ۳۰سی سی کلروفرم افزوده و دکانتور تکان داده می شود. پس از ۵ دقیقه دوباره ۳۰سی سی کلروفرم اضافه شده و به مدت ۲۴ساعت در این حالت قرار گرفت تا چربی استخراج شود. بعد از ۲۴ساعت برای جداسازی فازها ۳۶سی سی آب مقطر اضافه شد. بعداز ۲ ساعت فاز زیرین در بالن سرسمباده ای جمع شده و در روتاری قرار گرفت تا حلال آن تبخیر شود و فقط روغن باقی بماند. روغن استخراج شده برای اندازه گیری درصد چربی، FFA و PV مورد استفاده قرار گرفت. و میزان چربی برحسب درصد از طریق رابطه زیر بدست آمد.