۲-۴-۱۱- مروری بر مطالعات انجام شده:
اکسیداسیون در مواد غذایی باعث کاهش ارزش غذایی از طریق کاهش ویتامین ها و اسیدهای چرب ضروری بدنو همچنین منجر به تولید ترکیبات سمی می شودبرای کاهش این تغییرات از افزودنیها ی مصنوعی با خاصیت آنتی اکسیدانی بسیار استفاده می شود که در دهه اخیر به دلیل مشاهده خطرسرطانزایی و انزجار مصرف کننده ها، از این افزودنی های مصنوعی کمتر استفاده می شود و برای افزایش عمر ماندگاری و سلامتی غذا می توان از افزودنی های طبیعی با خاصیت آنتی اکسیدانی استفاده کرد.

عصاره رزماری به دلیل خاصیت آنتی اکسیدانی قوی که دارد در صنایع غذایی بسیار کاربرد دارد و این خاصیت بدلیل وجود ترکیباتی مثل سینام آلدئید که زنجیره تولید رادیکال های آزاد را با دادن یک اتم هیدروژن می شکنند و متعاقب آن اکسیداسیون چربی را به تاخیر می اندازد.( روباردس و همکاران، ۱۹۸۸)
اسانس ها و عصاره های گیاهان دارویی به عنوان مواد طبیعی محافظت کننده مواد غذایی و داروهای افزاینده سلامتی مطرح هستند، اکثر این ترکیبات با داشتن خاصیت آنتی اکسیدانی از استرس اکسیداتیو جلوگیری میکنند.(ملکی راد و همکاران، ۱۳۹۱)
با این حال تا به حال در ارتباط با ارزیابی اثرات ضد باکتریایی و آنتی اکسیدانی اسانس دارچین تجاری عرضه شده در داخل کشور هیچ مطالعه ای صورت نگرفته است.
مطالعات و تحقیقات وسیعی مشابه با این تحقیق در ایران و جهان انجام شده است. که در آنها از انواع گیاهان دارویی و بر روی انواع گوشت ها از جمله ماهی انجام شده است. که برای بهتر انجام شدن این مطالعه از موارد زیر بهره گرفته شده است.
در پژوهشی توسط علی اکبر ملکی راد و همکاران در سال ۱۳۹۱ انجام شد قابلیت اسانس و فراکشنهای مختلف عصاره متانولی آویشن شیرازی، مریم گلی، رزماری، خالواش و دارچین در مهار رادیکال های آزاد DPPH مورد بررسی قرار گرفت و نتایج نشان داد که تفاوت معنی داری بین اسانس و فراکشنهای مورد مطالعه از نظر فعالیت آنتی اکسیدانی وجود داشت.
در مطالعه ای دیگر که توسط مشاک و همکاران در سال ۱۳۹۰ انجام شد اثر همزمان اسانس دارچین و آویشن شیرازی بر ضد باکتری باسیلوس سرئوس در مدل غذایی سوپ مورد بررسی قرار گرفت.آنها نشان دادند که اسانس آویشن شیرازی به همراه دارچین دردمای نگهداری۱۰درجه سانتیگراد و اسانس آویشن شیرازی به تنهایی در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد می تواند رشد باسیلوس سرئوس را مهار کند.
اشمیت و همکاران در سال ۲۰۰۶ ترکیبات و اثر آنتی اکسیدانی اسانس برگ دارچین را مورد ارزیابی قرار دادند. در این پژوهش قدرت آنتی اکسیدانی اسانس دارچین با آنتی اکسیدان های سنتزی BHT,BHA مورد مقایسه قرار گرفت.که اسانس دارچین خاصیت آنتی اکسیدانی نسبتا خوبی از نشان داد.
ازکان در سال ۲۰۱۱ اثر آنتی اکسیدانی اسانس های رزماری، میخک و دارچین را بر روی روغن فندق و روغن خشخاش بررسی کرد.اسانس های مذکور با غلظت های مختلف به روغن ها اضافه شدند و از آنتی اکسیدان سنتتیک BHA به عنوان محلول استاندارد (کنترل) جهت مقایسه استفاده کردند.
نمونه های مرد مطالعه در دمای ۵۰ درجه سانتی گراد نگهداری شدند.فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس ها به روش اندازه گیری میزان پر اکساید مورد ارزیابی قرار گرفت.که مشاهده شد آنتی اکسیدان BHA در روزهای نخست انبارش اثر آنتی اکسیدانی قابل توجهی از خود نشان نداد،در حالی که اسانس های گیاهی مورد مطالعه اثر خوبی نسبت به BHA از خود نشان دادند که در این میان اسانس دارچین اثر قویتری در راستای به تاخیر انداختن اکسیداسیون چربی در نمونه ها از خود نشان داد و اسانس های میخک و رزماری از لحاظ اثر آنتی اکسیدانی به ترتیب پس از اسانس دارچین قرار گرفتند.
جبلی و همکاران در سال ۱۳۹۱ ظرفیت آنتی اسیدانی سه اسانس دارچین ،هل و زیره را مورد بررسی قرار دادند.جهت ارزیابی قدرت آنتی اکسیدانی اسانس های مذکور از روش DPPH بر مبنای درصد مهار تولید رادیکال آزاد استفاده شد.ونتایج نشان داد که اسانس دارچین دارای قدرت آنتی اکسیدانی قویتری در مقایسه با اسانس های دیگر از خود نشان داد و بعد از این اسانس به ترتبب اسانس های زیره و هل در رتبه های دوم و سوم قرار گرفتند.
چوا و همکاران در سال ۲۰۰۸ فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره اتانولی دارچین را مورد بررسی قرار دادند.آنها جهت این پژوهش از تست های DPPH,NBT,و قدرت احیا کنندگی و پراکسید لیپید با بهره گرفتن از مغز موش و درصد شلاته کنندگی استفاده کردند.آن ها علاوه بر ارزیابی قدرت آنتی اکسیدانی عصاره اتانولی این عصاره را با عصاره های ان هگزانی ،اتیل استاتی، ان بوتانولی و عصاره آبی دارچین از لحاظ خاصیت آنتی اکسیدانی مورد بررسی قرار دادند.
آگاروال و همکاران در سال ۲۰۱۲ در مورد اثر آنتی اکسیدانی و آنتی باکتریالی گونه های مختلف دارچین
از مناطق مختلف تحقیق و مطالعه کردند.تامالا^[۵۷] ،زیلانیکوم^[۵۸] و کامفورا^[۵۹] گونه های مورد مطالعه بودند.اسانس های مذکور توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS) مورد آنالیز قرار گرفتند.اثر آنتی باکتریالی اسانس ها در مقابل سه باکتری پاتوژنیک پاستورلا مالتوسیرا^[۶۰]،اشرشیا کلی^[۶
۱] و سالمونلا انتریکا^[۶۲] به روش دیسک دیفوژن انجام و در آخر با جنتامایسین مورد مقایسه قرار گرفت.
ارزیابی اثر آنتی اکسیدانی اسانس ها با ۳ روش آزمایشگاهی Metal chelating ،Reducing power, DPPH انجام پذیرفت. نتایج حاصله نشان داد که اسانس های هر سه گونه مورد مطالعه دارای اثر آنتی اکسیدانی آنتی باکتریالی خوبی هستند و میتوانند به عنوان نگهدارنده های طبیعی مورد استفاده قرار گیرند.
فصل سوم: مواد و روش ها:
۳-۱- مواد:
۳-۱-۱- تهیه اسانس ها:
-اسانس آزمایشگاهی^[۶۳]: اسانس دارچین آزمایشگاهی به روش تقطیر با آب^[۶۴] و توسط دستگاه کلونجر تهیه شد. بدین منظور، ۱۰۰ گرم پودر دارچین راکه از پوست این گیاه استحصال شده بود به همراه آب مقطر در بالن تقطیر ریخته سپس بالن تقطیر را به دستگاه کلونجر متصل کرده و تقطیر تا زمانی که دیگر به حجم اسانس اضافه نشود ادامه یافت که در پایان در حدود ۱ میلی لیتر اسانس (بازده ۱%) بدست آمد. پس از آن اسانس استخراج شده را توسط سولفات سدیم بدون آب آبگیری کرده و در نهایت به ظرف درب دار منتقل و تا زمان استفاده از آن درون یخچال نگهداری شد.
- اسانس تجاری دارچین^[۶۵]: دو اسانس تجاری دارچین با دو برند مختلف از بازار خریداری شد.
۳-۱-۲- کلیه مواد شیمیایی به کار برده شده:
-کلرید آهن II^[66]: که از نمایندگی شرکت مرک در ایران تهیه گردید.
- فروزین^[۶۷](۳- (۲پیریدیل)- ۵،۶دی فنیل- ۱و۲و۴- تریازین-^′۴و″۴- دی سولفونیکاسید سدیم سالت که از نمایندگی شرکت سیگما در ایران تهیه گردید.
- متانول که از شرکت دکتر مجللی تهیه گردید.
- کلریدآهن: که از نمایندگی شرکت مرک در ایران تهیه گردید.
-تری کلرو استیک اسید^[۶۸]: که از نمایندگی شرکت مرک در ایران تهیه گردید.
- فروسیانید پتاسیم^[۶۹]:که از نمایندگی شرکت مرک در ایران تهیه گردید.
- دی سدیم هیدروژن فسفات^[۷۰]
- سدیم دی هیدروژن فسفات^[۷۱]
- DPPH (1و۱-دی فنیل-۲-پیکریل-هیدرازیل) که از نمایندگی شرکت سیگما در ایران تهیه گردید.
۳-۲- روش کار:
شناسایی ترکیبات شیمیایی اسانس ها توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی متصل به طیف سنج جرمی^[۷۲] در آزمایشگاه گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی دانشگاه تهران انجام پذیرفت.
دستگاه GC/MS با ستون موئینه به طول ۳۰ متر و قطر داخلی ۲۵۰ میکرومتر و ضخامت لایه داخلی ۲۵/۰ میکرومتر با برنامه دمایی ۵۰ تا ۲۶۵ درجه سانتیگراد با افزایش تدریجی ۵/۲ درجه در هر دقیقه و نگهداری ستون در ۲۶۵ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ دقیقه استفاده شد.
دمای اتاق تزریق ۲۵۰ درجه سانتی گراد و گاز حامل هلیم با سرعت ۵/۱ میلی­لیتر در دقیقه بود.
شناساگر EI با انرژی یونیزاسیون ۷۰ الکترون ولت و دمای منبع یونیزاسیون ۲۵۰ درجه سانتی گراد بود شناسایی طیف ها به کمک شاخص بازداری آن ها صورت گرفت. شناسایی ترکیبات تشکیل دهنده اسانس با بهره گرفتن از شاخص های بازداری و بررسی طیف های جرمی ترکیبات مقایسه آنها با طیف های جرمی استاندارد موجود در کتابخانه های کامپیوتری و مراجع معتبر صورت گرفت.
ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی هر کدام از اسانس ها با ۳ روش آزمایشگاهی قدرت شلاته کنندگی^[۷۳]،
اثر ضد رادیکالی, DPPH قدرت احیا کنندگی^[۷۴] انجام شد.
۳-۲-۱- تست قدرت شلاته کنندگی:
به طور کلی مواد غذایی حاوی فلزات واسطه بوده و یا در طول زمان فرایند تولید به آن آلوده میشوند.عناصر واسطه دوظرفیتی نقش مهمی را به عنوان کاتالیزور در فرایندهای اکسیداتیو ایفا نموده و منجر به تشکیل رادیکال های هیدروکسیل و واکنش های تخریبی هیدروپراکساید می شوند (هالیول ۱۹۹۷)^[۷۵] این مراحل میتواند با شلاته شدن یون آهن به تاخیر افتاده یا غیر فعال شود. تست شلاته کنندگی با روش دنیز^[۷۶] (۱۹۹۴) انجام شد. برای انجام این آزمایش ۴۰۰ میکرو لیتر از غلظت های مختلف از اسانس ها (۳۰۰ تا ۵۰۰۰ میکروگرم در میلی لیتر) تهیه شد، سپس به هر کدام از غلظت ها ۵۰ میکرولیتر محلول ۲میلی مولار کلرید آهن II و ۲۰۰ میکرو لیتر محلول ۵ میلی مولار فروزین اضافه گردید که در این مرحله محلول ها به رنگ قرمز درآمدند که این امر مربوط به تشکیل کمپلکس فروزین - آهن است و پس از ۱۰ دقیقه انکوبه کردن در دمای اتاق، جذب نوری نمونه ها در دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm562 در برابر متانول خوانده شد و در نهایت درصد ممانعت از تشکیل کمپلکس قرمز رنگ آهن- فروزین توسط اسانس ها با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد، که I(%) درصد بازدارندگی ، A_C میزان جذب محلول کنترل و A_S میزان جذب نمونه است.
I(%) = (Ac-As/Ac)×۱۰

۳-۲-۲- تست قدرت احیا کنندگی:
احیاء آهن (III) اغلب به عنوان معیاری برای قابلیت الکترون دهی بکار می رود اندازه گیری قدرت احیاءکنندگی با روش اویایزو(۱۹۸۶)^[۷۷] انجام شد. برای انجام این تست ابتدا غلظت های مختلفی از اسانس ها (۲،۴ ، ۶ ،۸ ،۱۰ میلی گرم بر میلی لیتر) تهیه گردید و سپس ۱۰۰۰ میکرولیتر محلول بافر فسفات (۷PH= ) و ۱۰۰۰ میکرولیتر محلول فروسیانید ۱% به هر کدام از غلظت ها اضافه شد. این مجموعه به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۵۰ درجه سانتی گراد انکوبه شد. سپس به آن ۱۰۰۰ میکرولیتر محلول تری کلرو اسید استیک۱۰% اضافه گردید و به مدت ۱۰دقیقه با دور ۲۸۰۰ سانتریفوژ شد.در مرحله بعد فاز فوقانی با ۱۰۰۰ میکرولیتر آب مقطر و۱۰۰۰ میکرولیتر کلریدآهن۱/۰% مخلوط و سپس جذب آنها در طول موج ۷۰۰ نانو متر و در برابر محلول استاندارد (کنترل) خوانده شد.
۳-۲-۳- تست اثر ضد رادیکالی DPPH:
این تست با روش چانگ و همکاران^[۷۸] (۲۰۰۱) انجام شد. در این روش فعالیت آنتی اکسیدانی اسانسها با بهره گرفتن از روش اندازه گیری کاهش ظرفیت رادیکالی^[۷۹] به کمک DPPH مورد ارزیابی قرار گرفت. مهار رادیکال های آزاد یکی از شناخته شده ترین مکانیسم هایی است که به واسطه آن ترکیبات آنتی اکسیدانی می توانند اکسیداسیون چربی ها را مهار نمایند.
DPPH ترکیبی است بنفش رنگ که به دلیل حضور گروه های فنیل در ساختار آن، به راحتی به صورت رادیکال در آمده و در واقع منبع رادیکال آزاد می باشد. این ترکیب با گرفتن یک الکترون از ترکیب آنتی اکسیدان، از رنگ بنفش به زرد تغییر رنگ می دهد که این تغییر رنگ کاملا به غلظت اسانس ها بستگی دارد.با افزایش غلظت اسانس ها کاهش رنگ نیز افزایش میابد. در این روش ابتدا غلظت های مختلف از اسانس (۱۰۰،۵۰۰،۱۰۰۰،۱۵۰۰،۳۰۰۰،۴۵۰۰،۶۰۰۰ ،۰ میکرو گرم بر میلی لیتر) تهیه گردید سپس به هر کدام از غلظت ها ۵ میلی لیتر محلول DPPH % 004/0 اضافه شد و پس از ۳۰ دقیقه انکوبه کردن در دمای اتاق جذب نوری نمونه ها در دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج ۵۱۷ نانومتر در برابر متانول خوانده شد و در نهایت میزان کاهش ظرفیت رادیکالی با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد ، که:
I%=(Ac-As/Ac)×۱۰۰