مطالعه و شناسایی سویه¬های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز- قسمت ۸ | ... | |
Lamare et al.,1995, 1997
Biphasic medium
Lyophilized preparation
کوتیناز لیوفیلیزه برای تعیین مکانیسم واکنش stereoselectivity استفاده شده است، کوتیناز لیوفیلیزه همچنین به یک سیستم دوفازی آبی- ترئولین اضافه شد که این تریگلیسیرید را به اسید اولئیک و گلیسرول هیدرولیز می کند [۵۹]. کوتیناز بر روی بسترهای جامد بصورت جذبی یا اتصال کوولانت تثبیت شده و در هیدرولیزهای مختلف[۶۰-۶۲]، استریفیکاسیون [۶۳] و واکنش تبادل استری [۶۴-۶۶] استفاده می شود. بیشتر مطالعات جذبی کوتیناز بر روی Accurel EP 100، یک بستر macroporous polypropylene انجام شده است [۶۳]. این بستری مناسب برای تثبیت کوتیناز است که منجر به اماده سازی انزیم فعال و با ثبات می شود.
برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید. عملکرد کوتیناز در واکنشهای هیدرولیزی و سنتزی
هیدرولیز هیدرولیز تریگلیسیریدها و انالوگها به وسیله کوتیناز در چندین سیستم واکنش برای مثال در میسل معکوسAOT و سیستم های دو فازی مورد مطالعه قرار گرفته است. در سیستم دو فازی تبدیل triolein با بهره گرفتن از یک سیستم تک لایه دنبال شد [۵۸]. آنالیز کینتیک هیدرولیز تریگلیسریدهای مختلف، تریکاپریلین، تریلورین و تریمریستین tricaprylin, trilaurin and) trimyristin) نیز انجام گرفته است [۶۹]. کوتیناز فعالیت بیشتر و اختصاصی را برای زنجیره کوتاهتری گلیسیرید مورد مطالعه نشان میدهد. این نتایج مطابق با دیگر یافته ها درباره انتخابی بودن و اختصاصیت کوتیناز است.
استریفیکاسیون سنتز استر اسیدهای چرب به وسیله کوتیناز در میسل معکوس از هر دوسورفاکتانت های AOT انیونی [۷۳] و CTAB کاتیونی [۷۰] مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته است. استریفیکاسیون اولئیک اسید با الکل های الیفاتیک به وسیله کوتیناز محصور شده در میکرو کپسولهای میسل معکوس AOT نشان داد که کوتیناز دارای اولویت برای C5 به الکل های C6 است [۷۳]. اثر طول زنجیره اسیدچرب در استریفیکاسیون هگزانول نیز مورد بررسی قرار گرفت و حداکثر فعالیت با بوتریک اسید بدست امد، بعضی واکنش ها نیز با کوتیناز محصور شده در میسل معکوس CTAB انجام شده است[۷۰]. کوتیناز با حداکثر فعالیت استریفیکاسیون از هگزانول با بوتریک اسید نتایج مشابهی می تواند بدست اید. با این حال فعالیت کوتیناز در میسل معکوس AOT بیشتر از میسل معکوسCTAB است.
ترانس استریفیکاسیون واکنش ترانس استریفیکاسیون بوتیل استات با هگزانول در محیط های آلی در چندین سیستم سنجیده شده است [۱]. اثرات شرایط واکنش روی فعالیت های تبادل استری از کوتیناز محصور شده در میکروکپسولهای میسل معکوس AOT با بهره گرفتن از روش های طراحی فاکتریول مورد بررسی قرار گرفت [۷۶].
پایداری کوتیناز پایداری حرارتی و عملکردی کوتیناز در اماده سازی انزیم در شرایط واکنش مختلف مورد بررسی قرار گرفته است [۱۱, ۷۳, ۷۵, ۷۷] (جدول ۲-۴). در بسیاری از مطالعات به بررسی میسل معکوس در کوتیناز میکروکپسوله شده، به ویژه در میسل معکوسAOT به دلیل فعالیت های بالای بدست امده پرداخته اند. اولین گزارش روی پایداری کوتیناز محصور شده در میکروکپسول های میسل معکوس AOT نشان داد که نیمه عمر انزیم بسیار کوتاه است. در ω۰ ۱۰ و pH 6/9 در ۲۵ درجه سانتیگراد نیمه عمر ۱۵/۰ ساعت تعیین شد و تنها ۲۰ درصد از فعالیت های اولیه در ω۰ ۲۰ باقی ماندند[۷۸, ۷۹]. این نتایج در مطالعات انجام شده توسط Papadimitriou و همکاران بر تاثیر ω۰ روی پایداری کوتیناز در میسل معکوس ایزواکتان/AOT، ۱/۰M تایید شد (جدول۲-۵). غیر فعال کردن سریع کوتیناز در AOT معکوس شده ی میسلی با توجه به روند برگشت پذیر دناتوراسیون رخ می دهد. دناتوراسیون احتمالا توسط تعامل بین انزیم و رابط سورفاکتانت از میسل معکوس ایجاد می شود، زیرا در محلول ابی، انزیم ازاد تا درجه حرارت ۸۵ درجه را تایید می کند و در غیاب اب (پودر لیوفیلیزه) درجه حرارت بهینه برای ترانس استریفیکاسیون ۸۰ درجه سانتیگراد می باشد [۶۶]. هنگامی که اندازه ی حفره ابی میسلی معکوس تو خالی کوچکتر از کوتیناز باشد(به عنوان مثال ω۰ ۵) یک مدل سه حالته، دناتوراسیون و غیر فعال کردن با یک حالت کنفورماسیونی حدواسط موجود در مسیر کوتیناز طبیعی به دناتوره را توضیح می دهد. در ω۰ ۲۰ نشان داده شده که اندازه میسل خالی بزرگتر از کوتیناز و داده ها توسط یک مدل دو حالته که در انها تنها کوتیناز طبیعی و دناتوره حضور داشتند توصیف شد [۷۹]. استراتژی های تثبیت کننده برای این سیستم انزیمی ایجاد شده است. ویژگی مهمی که تاثیر مثبت بر حفظ فعالیت کوتیناز می گذارد استفاده از الکل،یعنی هگزانول است، که از غیر فعال کردن کوتیناز جلوگیری می کند [۷۳]. نیمه عمر کوتیناز در میسل معکوس AOT حاوی ۲۵۰Mm هگزانول در pH 10 و در ℃ ۱۵ و ω۰ ۴ در حدود ۶۰ روز نشان داده شده است [۷۳]. روشی که در ان کوتیناز محصور شده در میکروکپسول های هگزانول حفاظت می کند هنوز هم مورد بحث و بررسی است. فرایندهای در حال توسعه: بیوراکتور کوتیناز تعداد اندکی از کارهای انجام شده در مورد توسعه فرایند و بیوراکتورهای کوتینازی منتشر شده است[۱۱, ۶۶]. بستر بیوراکتور گاز جامد توسعه داده شد تا واکنش ترانس استریفیکاسیون، انجام تبادل استری متیل پروپیونات و پروپانول با بهره گرفتن از کوتیناز لیوفیلیزه شده به عنوان فاز جامد انجام بگیرد. مطالعات راکتور نسبتا محدود بود به دلیل اینکه هیچ داده ای که اثر سرعت جریان گاز را روی تبدیل نشان دهد ارائه نشده است. از خصوصیات اصلی این مطالعه واکنش مداوم برای ۱۵۰ ساعت در ۶۵ درجه سانتیگراد بدون از دست دادن فعالیت است. عملکرد BSTR ( Batch stirred-tank reactor) برای هیدرولیز تریپسین با کوتیناز جذب شده بر روی زئولیت NaY آنالیز شده است. مطالعات کینتیکی در این نوع راکتور و همچنین اثرات انتقال جرم روی فعالیت آنزیمی انجام شده است. بیشترین مطالعات در یک راکتور غشایی میسلی معکوس (MBR) شامل کوتیناز های میکروکپسوله شده برای ترانس استریفیکاسیون از بوتیل استات با هگزانول انجام شده است. کوتیناز پس از بهینه سازی مطالعات پایداری کوتیناز با ω° و هگزانول یک مولار در میسل های معکوس AOT میکروکپسوله شده است.
مکانیسم عمل کوتیناز مکانیسم عمل به این صورت است که ابتدا سوبسترا از طریق کربن متصل به گروه کربونیل خود به جایگاه فعال متصل می شود، سپس سرین سه گانه کاتالیتیک به کربن کربونیل حملهی نوکلئوفیلی می کند و هیستیدین با جذب پروتون گامای سرین سبب فعال شدن اکسیژن گاما و متعاقب آن آماده کردن آن برای حمله نوکلئوفیلی می شود. نتیجه حملهی نوکلئوفیلی، تشکیل پیوند کوولان بین اکسیژن گامای سرین و کربن سوبسترا و ایجاد حدواسط تتراهدرال است. بار منفی که همزمان با تشکیل حدواسط تتراهدرال به اکسیژن کربونیل منتقل شده با تشکیل پیوند هیدروژنی بین دو گروه آمید سرین و گلوتامین به عنوان دهنده و اکسیژن کربونیل به عنوان گیرنده پایدار میگردد. به این بخش خاص آنزیم به علت پایدارسازی بار منفی اکسیژن، حفره اکسی آنیون گفته می شود. شکل۲‑۹ مکانیسم عمل کوتیناز [۱۴] همچنین میزان پایداری TfCa در شرایط دمایی و pH های مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. این مطالعه نشان میدهد که در شرایط pH=8 و دمایی برابر ۵۰ درجه سانتیگراد آنزیم کوتیناز دارای بالاترین فعالیت در مدت زمان ۱۰۰ ساعت است. در شکل ۲-۱۱ زیر توانایی و میزان مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما و PH قابل مشاهده است ۲‑۱۰ گسترهی مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما وpH [80] شکل ۲‑۱۱نمودار دما و pH [80]
مقایسه آنزیم کوتیناز قارچی و باکتریایی آنزیم کوتیناز از باکتری ترموفیل Thermobifida fusca که در مقایسه با گونهیfusarium solani دارای پایداری بسیار بالا در حلالهای آلی و پایداری دمایی بیشتری میباشد دارای فعالیت نزدیک به کوتیناز قارچی در برابر سورفاکتانت ها و یونهای فلزی میباشد. جدول ۲-۶ میزان فعالیت آنزیم کوتیناز را در برابر سوبسترهای مختلف در دو گونه فوق نشان میدهد. نشانگرهای ژنتیکی تنوع ژنتیکی عامل اصلی تکامل یک ژنوم به شمار میرود. چندشکلی طبیعی ناشی از تغییر توالیهای DNA در ژنومهای گیاهی و جانوری در بین و داخل یک گونه اساس ایجاد تنوع ژنتیکی میباشد. در سالهای اخیر پیشرفتهای چشمگیری در زمینه زیست شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی صورت گرفته است که ابزار قدرتمندی را برای پژوهشهای ژنتیک تفضیلی گیاهان عالی از جمله گیاهان زراعی و همچنین اجداد وحشی گیاهان زراعی فراهم کرده اند. تفاوت نشانگرهای مولکولی مبتنی بر چندشکلیهای طبیعی است. پس از زمان کشف ساختمان اولیه DNA، در تعدادی از گونه ها خصوصیات آن بر محققان مکشوف شده است. چندین سیستم برای آشکارسازی نشانگرهای مولکولی که قادر به شناسایی و برآورد تنوع موجود در توالیهای DNA ژنومی میباشند، به منظور انجام مطالعات ژنتیکی ابداع و معرفی شده است. نشانگرها به دو دسته کلی تقسیم میشوند.
نشانگرهای مورفولوژیکی به این نشانگرها، نشانگرهای کلاسیک یا ظاهری هم گفته می شود که در واقع همان صفات یا خصوصیات فنوتیپی قابل رویت هستند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل میشوند، میتوانند به عنوان نشانگرهای ژنتیکی مورد قرار میگیرند. این نشانگرها شامل دامنه وسیعی از ژنهای کنترل کننده صفات فنوتیپی هستند و از نخستین نشانگرها به شمار میآیند. ولی این نشانگرها دارای محدودیتهای زیادی هستند. به همین دلیل محققین از نشانگرهای دیگر استفاده می کنند. از جمله معایب این نشانگرها:
اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی دارند. تحت شرایط محیطی یا مرحله نمو گیاه قرار میگیرند. فراوانی و تنوع کمی دارند. در بعضی مواقع برای مشاهده و ثبت اینگونه نشانگرها باید زمان طولانی را منتظر ماند. پایه ژنتیکی بسیاری از نشانگرهای مورفولوژیکی هنوز ناشناخته مانده است. تنها بخش کوچکی از ژنوم را پوشش میدهند، بنابراین بخش اعظم نواحی کروموزومی غیر قابل دسترس می شود.
[سه شنبه 1400-01-24] [ 10:15:00 ب.ظ ]
لینک ثابت |