۲-۲۳. پیشینه تحقیق پروتئومیکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بوویس
Malen و همکاران (Zoll)، مقایسه پروتئین­های غشایی M. tuberculosis سویه H37RV و H37Ra برای تعیین خصوصیات بیش از ۱۷۰۰ پروتئین در هر دو سویه را بررسی کرده ­اند. در این بررسی تقریبا” اکثر پروتئین­های تعیین شده (identified) به میزان بسیار زیادی با هم شبیه بودند با این وجود ۲۹ پروتئین غشایی یا متصل به غشا (membrane associated) با ۵ یا بیشتر از آن دارای تفاوت یک سویه با سویه دیگر بوده ­اند. ۱۹ پروتئین و لیپوپروتئین درH37RV دارای فراوانی حداکثری بوده ­اند در صورتیکه ۱۰ پروتئین در سویه H37Ra بیشترین تعداد را داشته اند. ۶۶ لیپوپروتئین در هر دو سویه مشترک بوده در حالیکه ۷ لیپوپروتئین فقط در H37Ra و ۳ لیپو­پروتئین در H37RV دیده شده ­اند (نشان دهنده اختلاف). این مطالعه از سویه های استاندارد ATCC و محیط کشت جامد (۷H10) استفاده کرده است (Malen H. et al., 2011).

Singhal و همکاران (۲۰۱۲)، پروتئین­های خارج سلولی (Intera cellular)، M. tuberculosis از ایزوله­های بالینی را مورد بررسی قرار دادند. M. tuberculosis حساس به دارو (حساس به حداقل ۵ داروی خط اول از خانواده ST11-EA13-IND) و M. tuberculosis مقاوم به دارو MDR، (مقاوم به ریفامپین-ایزونیازید و استرپتومایسین از خانواده ST288-CAS2) از مرکز بیماری­های ریوی JALMA (هند) انتخاب گردیده­اند. از محیط کشت مایع Sautons استفاده شد و باکتری­ ها در فاز Late exponential (هفته سوم) جداسازی گردیده­اند. در مقایسه انجام شده با ۲DE و MS برخی پروتئین­ها Upregulate بوده ­اند. ۴ پروتئین در هر دو گروه MDR و حساس مشترک بوده ­اند و ۳ پروتئین اختصاصا” به متابولیسم و زنجیره تنفسی باکتری تعلق داشته است. نتایج نشان داد که عمده پروتئین­های Upreguale/expresse متعلق به متابولیسم سلولی و تنفسی باکتری است. در این مطالعه همچنین از کشت سلولی ماکروفاژ (THP-1) و آلوده­سازی سلول با مایکوباکتریوم نیز استفاده شد. روی هم رفته پروتئین­های تعیین شده (شناخته شده) در اینترافاگوزومال احتمالا” در سازگاری باکتری با محیط نقش دارند، درک عمل پروتئین­های تعیین شده با شرایط ماکروفاژ سازگار است. القا بیان آنها در Invitro احتمالا” به تفسیر استراتژی M. tuberculosis در ایجاد عفونت و افزایش بقای سلول TB می­انجامد. تعیین دقیق این پروتئین­ها به ما اجازه می­دهد تا دخالت آنها در عمل ساختاری TB و رشد مایکوباکتری در محیط کمک کند(Singhal N. et al., 2012).
Zhang و همکاران (۲۰۱۲) برای تشخیص مقاومت دارویی در M. tuberculosis و پیدا کردن بیومارکر قوی و موثر، سرم بیماران با مقاومت دارویی و حساسیت دارویی به TB و همچنین سرم­ افراد سالم را در معرض ۲DE و MS قرار داد که با این روش ۹ پروتئین جدا نمودند، ۶ پروتئین نوترکیب را برای تعیین Immunu reactivity ،۱۰۰ نمونه سرم استفاده نمودند. آنتی­بادی بر علیه پروتئین­های نوترکیب مورد بررسی قرار گرفت. بهترین حساسیت و ویژگی از ترکیب پروتئین نوترکیب و پروتئین­های جدا شده به دست آمد (Zhang L. et al., 2012).
Starck و همکاران (۲۰۰۴) پروتئومیکس مقایسه­ ایM. tuberculosis در شرایط هوازی و غیرهوازی را انجام دادند. با بهره گرفتن از ۲DE و MS تعداد ۵۰، spot پروتئینی را انتخاب کرده و از بین آنها ۱۶پروتئین را مورد MALDI-TOF قرار دادند. داده ­های این بررسی نشان داد که القا الگوی پروتئینی، در طول فاز رشد (Exponential) و فاز ثابت متفاوت است (Starck J. et al., 2004).
Monahan و همکاران (۲۰۰۱) بیان متفاوت پروتئین­های مایکوباکتریایی را طی فاگوسیتوز ماکروفاژ بررسی کردند. این بررسی با باکتری M .bovis BCG و سلولTHP-1 انجام شد. این بررسی نشان داد که پروتئین­های بیان شده در BCG در حالیکه باسیل در داخل ماکروفاژ است در طول رشد در Invitro در محیط کشت و یا در شرایط شوک حرارتی بیان نمی­شوند. همچنین نشان داده شد که ۶ پروتئین در داخل ماکروفاژ دچار ازدیاد بیان می­شوند که شامل کریستالین (۱۶ KDa) GroEL1، GroEL2، یک پروتئین ۳۱.۷KDa (RV2623) inhA و یک فاکتور به نام TUF بوده است (Monahan IM. Et al., 2001).
Malen و همکاران (۲۰۰۷)، آنالیز پروتئین­های M. tuberculosis H37RV را گزارش کردنده­اند. این بررسی پپتیدهای مشتق شده از ۲۵۷ پروتئین را نشان داد. چندین پروتئین ترشحی با خاصیت ایمونوژنیکی از جمله ESAT-6 در این گروه قرار دارند (Malen H. et al., 2007).
Rosenkands و همکاران (۲۰۰۰)، از M.tuberculosi H37RV، و روش ۲DE و میکروسکویئنسینگ برای تعیین پروتئین­های ایمونوژنیک TB استفاده کردند. این بررسی از آنتی­بادی­های منوکلونال تجارتی برای Immunio detection بهره گرفت (Rosenkrands I. et al., 2000).
Li و همکاران (۲۰۱۰)، پاسخ­های سویه­های ویرولان و تخفیف داده شدهM. tuberculosis H37RV در آلوده کردن ماکروفاژها را بررسی کردند. این مطالعه تفاوت بیان در تعداد بیشتر از ژن­های H37RV در نتیجه عمل پروتئین ESAT-6 و نیز پروتئین­های ترشحی را نشان داد (Li A H. et al., 2010).
Xing و همکاران (۲۰۰۵)، به بررسی M. tuberculosis H37RV برای تعیین پروتئین­های غشایی با الکتروفورز تک بعدی و MS پرداختند. از ۳۴۹ پروتئین معرفی شده ۱۰۰ پروتئین غشایی بودند (Xiong Y. et al., 2005).
Jing و همکاران (۲۰۰۶)، به مقایسه پروتئوم M. tuberculosi سویه مقاوم و حساس به ایزونیازید پرداختند. در این مطالعه از ۹ سویه مقاوم به monoresistance INH ، ۷ سویه حساس به INH و یک سویه H37RV در محیط کشت مایع ۷H9 استفاده شد. سویه پس از RFLP و سونیکه مستقیما” به میزان ۱۰۰µg/ml (توتال پروتئین) برای ۲DE، Load گردید. نتیجه RFLP نشان داد که ۱۷ سویه از لحاظ اپیدمیولوژیکی مستقل هستند یعنی سویه ها از نظر ژنتیکی متفاوت هستند. در ۲ سویه INH مقاوم مکانیسم مقاومت با ۷ سویه دیگر متفاوت بود در مقایسه الگوی ۲DE حساس و مقاوم به INH که ۳ بار تکرار شده بود، فقط آنهایی انتخاب شدند که Spot آنها در همه آنالیزها وجود داشت. کلا” تغییرات نوکلئوتیدها در ۵ تمایز پروتئینی از تمام حساس­ها و مقاوم­ها مشابه هم بوده است که این خصوصیت احتمالا” مربوط به پروفایل مولکولی سویه­های چینی است. تفاوت در بیان مرتبط با مکانیسم مقاومت به INH نیست، به بیان دیگر مرتبط با موتاسیون katG نیست. در الگوی ۲DE ،۵ پروتئین از ۲۰ پروتئین متفاوت بیان شده با MS تعیین شد. این ۵ پروتئین Overexpress داشته اند (Unregulated). نقش این ۵ پروتئین در مقاومت INH کاملا” مشخص نیست و مقایسه پروتئین حساس و مقاوم به INH نشان دهنده Upregulate بوده و این ۵ پروتئین در INH مقاوم بوده و بیشتر آنها پروتئین­های غشایی هستند. این پروتئین­ها می­توانند احتمالا” به عنوان مارکر برای اهداف تشخیصی و یا دارویی استفاده گردند ( Jiang X. et al., 2006).
فصل سوم
مواد و روش­ها
موادوروش­ها
در مطالعه حاضر که طی فروردین ماه تا آبان ماه سال ۱۳۹۲ انجام پذیرفت، از نمونه­های ارسالی به بخش مایکوباکتریولوژی انسیتو پاستور، ۱۰۰نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت، و همچنین از نمونه­های سال­های ۹۰ و ۹۱ نیز به منطور بررسی M. bovis استفاده گردید. نمونه­های مشکوک ابتدا بر روی محیط­های اختصاصی با توجه به استاندارد­هایCDC کشت و از آنها اسمیر مستقیم تهیه شد.
مراحل روش تحقیق
این پژوهش بر طبق محورهای زیر انجام پذیرفت:
۱-نمونه گیری
۲-کشت به روش کلاسیک روی محیط جامد اختصاصی
۳-تشخیص میکروسکوپی مایکوباکتریوم­ها
۴-بررسی لوله­های کشت
۵-تعیین هویت مایکوباکتریوم­های رشد یافته توسط تست­های بیوشیمیایی
۶-انجام تست حساسیت دارویی در مایکوباکتریوم­ها
۷-کشت سویه­های انتخابی در محیط میدل بروک ((۷H9
۸-جمع­آوری سویه­ها میکروبی، استخراج و خالص­سازی پروتئین
۹-الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (SDS-page)
۱۰-آنالیز داده ­ها
مراحل انجام کار
۳-۱. نمونه گیری
ابتدا اطلاعات پرونده بیماران مراجعه کننده بررسی ­گردید و اطلاعات مورد نظر در رابطه با جنسیت، سن، ملیت، سابقه ابتلا به بیماری، نوع نمونه­ها، سابقه تماس نزدیک با افراد آلوده و یا مشکوک به سل، سابقه پزشکی فرد از لحاظ وجود نقص سیستم ایمنی (ایدز)، PPD و نتیجه رادیوگرافی ریه جمع­آوری ­شدند.
نمونه­های جمع آوری شده دارای یکسری اصول نمونه گیری به شرح زیر می­بود که این اصول توسط بخش مایکوباکتریولوژی انسیتو پاستور رعایت می­گردید.
برای گرفتن بهترین نتیجه، شرایط نمونه گیری ذیل را باید رعایت کرد:
جمع­آوری نمونه­ها قبل از شروع هر گونه دارو درمانی باید انجام شود.
نمونه­ها در ظرف تمیز، استریل، یکبار مصرف پلاستیکی و معدوم شدنی (disposable) جمع آوری شود.
نمونه­ها باید هر چه سریعتر به آزمایشگاه منتقل شود، اگر تحویل نمونه­ها به تعویق می­افتد، بعد از نمونه گیری، نمونه­ها در یخچال قرار گیرد.
در ظروف نمونه باید محکم بسته شود.
کارمندان مسئول جمع­آوری و حمل و نقل نمونه­ها باید برگه دستورالعمل نمونه گیری، که حاوی مراحل جمع­آوری نمونه و نکات مهم است همیشه همراه خود داشته باشند و در صورت نیاز نکات آن ­را مورد توجه قرار دهند.
جداسازی موفق مایکوباکتریایی احتیاج به نمونه گیری مناسب، حمل سریع و پردازش صحیح نمونه­ها دارد.
هرگز در آزمایشات مایکوباکتریولوژی از مواد ثابت­کننده (Fixative) و نگهدارنده (Preservative) استفاده نشود.
ظروف نمونه گیری نباید به موم آغشته باشد.
برای جداسازی مایکوباکتریوم­ها مصرف سواپ پیشنهاد نمی­ شود مگر در موارد خاصی که امکان گرفتن نمونه به طریق دیگر ممکن نباشد.
۳-۲. کشت و جداسازی باکتری
بعد از دریافت نمونه، آنها را به اطاق کشت برده و با روش N– استیلL–سیستئین^[۶۷] کشت داده شدند. از محیط کشت لوون اشتاین جانسون^[۶۸] استفاده شد که این محیط طبق فرمول زیر آماده ­گردید.
۳-۲-۱. مواد مورد نیاز برای تولید محیط لوون اشتاین جانسون به میزان ۵/۱ لیتر
فسفات منو پتاسیم بدون آب (KH₂PO₄): 4/2 گرم
سولفات منیزیوم آبدار (MgSO₄+7H₂O): 24/0 گرم
سیترات منیزیم (magnesium citrate): 6/0 گرم
آسپاراژین (Asparagine): 6/3 گرم
گلیسرول (Glycerol reagent grade): 12 میلی­لیتر
تخم مرغ تازه: ۱۰۰۰ میلی­لیتر
مالاشیت گرین ۲%: ۲۰ میلی­لیتر
آب مقطر: ۶۰۰ میلی­لیتر
۳-۲-۲. طرز تهیه محیط کشت
پس از مخلوط کردن مواد فوق، محلول به مدت ۳۰ دقیقه در ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد اتوکلاو ­شد.