۳۴

۲

Min 5 / ˚۷۲

-

-

۱

۳

۳-۳-۵- الکتروفورز محصولات PCR
یکی از ساده ترین روش های تأیید محصولات PCR، الکتروفورز می باشد. “الکتروفورز” (Electrophoresis) به حرکات ذرات، در یک محیط مایع یا نیمه جامد، تحت میدان الکتریکی گویند. به سبب این که ماکرو مولکول های زیستی مانند DNA و پروتئین ها، باردار هستند می‌توان با قرار دادن آن ها در یک میدان الکتریکی، آن ها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی به نام الکتروفورز استفاده می‌شود ]۲۱[.

مطالعه الکتروفورز DNA در سال ۱۹۶۴، زمانی که ۳ گروه از محققان حرکت در محلول آزاد را با بهره گرفتن از روش های محدود و مرزی اندازه گیری کردند، آغاز شد. آن ها دریافتند که حرکت برای مولکول های DNA بزرگتر از ۴۰۰ جفت باز، مستقل از اندازه بود. در حدود همان زمان، با الهام گرفتن از روش جدایی پروتئین ها در ماتریکس ژل مصنوعی، محققان دیگر، شروع به استفاده از ماتریکس های مشابه برای جداسازی مولکول هایDNA و RNA براساس جرم مولکولی نمودند. ماتریکس جدایی شامل: پلی آکریل آمید، آگاروز، آگار و ترکیب ژل های آگاروز- آکریل آمید می باشد ]۴۵[.
در الکتروفورز ژل، از یک محیط نیمه جامد به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی ‌آکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم می‌شود. مولکول هایDNA در یک میدان الکتریکی از سمت کاتد (منفی) به سمت آند (مثبت) حرکت می نمایند. قطعات بزرگتر، کندتر و قطعات کوچکتر، به سرعت حرکت می کنند. بنابراین در این ژل‌ها، مولکول‌های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول‌های بزرگ‌تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند ]۳ و ۲۱[.
۳-۳-۵-۱- ژل آگاروز
ژل آگاروز، یک پلیمر متناوبی از ترکیبات “β-D گالاکتوز” و “انیدرو α- L گالاکتوز” می باشد. مولکول های آگاروز در حالت محلول، یک ساختار سیم پیچ تصادفی را در دماهای بالا ایجاد می کنند. پس از سرد شدن محلول، زنجیره های آگاروز دسته های فیبری مارپیچی را تشکیل می دهند که توسط پیوند های هیدروژنی به یکدیگر متصل شده اند ]۴۵[.
برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگاروز استفاده می‌شود. زیرا علاوه بر این که غیر سمی می باشد، تهیه ژل مزبور به مراتب سریع تر و آسان تر از ژل پلی آکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می‌گیرد و همچنین برای جداسازی قطعات بزرگDNA مناسب می باشد.
درصد آگاروزی که استفاده می شود، وابسته به سایز قطعهDNA می باشد. غلظت آگاروز، به عنوان درصد آگاروز به حجم بافر (w/v)در نظر گرفته می شود و به طور معمول از ۲/۰% تا ۳% مورد استفاده قرار می گیرد. در جدول ۳-۵ غلظت ژل آگاروز با توجه به اندازه قطعاتDNA مورد استفاده نشان داده شده است ]۳۷[.
جدول ۳-۴- نسبت غلظت آگاروز به سایز قطعاتDNA
۳-۳-۵-۲- بافر الکتروفورز
بافرهای مختلفی برای الکتروفورز آگاروز استفاده می شود. دو نوع از متداول ترین بافرهایی که برای اسیدهای نوکلئیک به کار برده می شوند، TAE (Tris Acetate EDTA) و TBE (Tris Borate EDTA) می باشند. قطعات مختلفDNA ، با سرعت های متفاوتی در این دو نوع بافر، به علت تفاوت در قدرت یونی شان حرکت می کنند. بافرها نه تنها ایجادکننده ی pH ایده آل هستند، بلکه یون های لازم برای رسانایی و هدایت را فراهم می نمایند ]۲۰ و ۳۷[.
به طور کلی، بافرها برای برقراری جریان الکتریکی کاربرد دارند. بنابراین بافر ایده آل باید رسانایی خوبی داشته باشد، حرارت کمتری تولید کند و همچنین دارای نیمه عمر بالایی باشد. بافر TAE ، شفافیت و وضوح خوبی برای DNAهای بزرگی که نیازمند زمان بیشتر و ولتاژ پایین تر هستند را فراهم می نماید ]۳۷[. در این طرح، از بافر TAE برای مخلوط کردن و به غلظت رساندن پودر آگاروز و نیز در تانک الکتروفورز استفاده گردید.
۳-۳-۵-۳- شناسگر وزن مولکولی DNA
برای ارزیابی سریع و درستی از حرکت DNA در میان ژل از شناسگرهای سایز DNA استفاده می شود. یک روش سریع و مناسب برای ارزیابی اندازه DNA، مقایسه موقعیت باندها با رشته های DNA است، که مخلوطی از قطعات DNA با سایزهای مختلف و تعریف شده می باشند، این رشته ها را نردبان یا Ladder می نامند، که همزمان با محصولات DNA در چاهک اول بارگذاری می شود. اندازه ی باندهای این نوع شناسگرها قبلا مشخص شده است. اگرچه، تخمین سایز DNAبه وسیله مقایسه با این Ladderها می تواند با حداقل خطای ۵% صورت بگیرد، اما برای بسیاری از اهداف رضایت بخش بوده است ]۲۱[. در این مطالعه، یک نوع شناسگر، به نام Gen Ruler TM DNA Ladder,100 bp or 1kbp شرکت “بیوتک پیشگام مورد استفاده قرار گرفته است (شکل ۳-۴).
شکل۳-۴- شناسگر وزن مولکولی DNA
۳-۳-۵-۴- طرز ساخت ژل آگاروز و بافر TAE
در این پژوهش، ابتدا بافر۱X TAE آماده می گردد. برای این کار از ۵۰X TAE استفاده نموده، و ml1 از آن با ml49 آب دوبار تقطیر، مخلوط می گردد تا محلول یکنواختی ایجاد شود. با افزایش رقت بافر ۵۰X TAE، بافر۱X TAE می توان تهیه نمود.
سپس ژل آگاروز را تهیه نموده، به طوری که پودر آگاروز را با ترازو اندازه گیری کرده و مقدار مناسبی از آن را با توجه به تعداد نمونه ای که قصد بارگذاری داریم با بافر TAE مخلوط نموده و مخلوط را در ۳ دور متوالی با زمان ۳۰ ثانیه داخل مایکروویو گرم کرده به طوری که بین هر ۳۰ ثانیه ارلن حاوی مخلوط خارج و تکان داده می شود تا مخلوط یکنواخت شود. پس از گرم کردن، محلول را روی شیکر قرارداده تا همزمان با حل شدن کامل و یکنواخت، محلول تا حدودی سرد شود.
اندکی پس از خنک شدن، محلول را داخل تانک یا سینی الکتروفورز ریخته و شانه (Comb) مخصوص تانک را داخل آن قرار و مدت ۳۰ دقیقه زمان داده تا ژل به صورت نیمه جامد درآید. پس از سفت شدن ژل ، Comb به آرامی برداشته و چاهک های ایجاد شده در ژل مشاهده می شود. سپس بافر TAE را روی ژل و داخل تانک ریخته تا سطح ژل را کاملا بپوشاند، با این کار از ته نشین شدن و فرو رفتن نمونه ها در چاهک ها جلوگیری می گردد. در این مرحله تانک الکتروفورز آگاروز آماده بارگذاری محصولات DNA می باشد. در این تحقیق از ژل آگاروز ۵/۱ % استفاده شده است.
۳-۳-۵-۵- بارگذاری محصولات PCR
پس از آماده سازی کامل تانک و ژل ، در خانه اول از سمت چپ، µl 5 از سایز مارکرDNA یا نردبان را ریخته و در خانه دوم نیز µl 5 نمونه کنترل منفی که حاوی پرایمرهای REVERSE ،FORWARD ، آب ۲ بار تقطیر و Master Mix، می باشد قرار داده می شود.
سپس µl5 از محصولات PCR به آرامی با سمپلر داخل چاهک ها قرار داده و درپوش تانک گذاشته و به منبع تغذیه متصل می شود. ولتاژ لازم برای تانک ۱۲۳ ولت می باشد. در این حالت بهترین جریان ایجاد شده حدود ۵۵ میلی آمپر است.
برای ایجاد باندهای DNA و حرکت آن ها به سمت آند ۳۰ دقیقه زمان نیاز است. پس از سپری شدن زمان مورد نظر، باندها به رنگ قرمز مشاهده می شوند. این رنگ به دلیل رنگی است که در مستر میکس موجود می باشد. DNA Ladderها ، نیز به رنگ آبی طراحی و مشاهده می گردد.
۳-۳-۶- رنگ آمیزی و مشاهده باندهای DNA
مکان DNA، درون ژل آگاروز را به طور مستقیم می توان از طریق رنگ آمیزی با Gel red و مشاهده آن زیر نور فرا بنفش (UV)، تعیین نمود. ژل بلافاصله پس از رنگ آمیزی با یک لامپ ماوراء بنفش، معمولا با قرار دادن آن در دستگاه UV Trans luminator، مشاهده می گردد و برای ثبت تصاویر آن، می توان از ژل عکس تهیه نمود. تصاویر معمولا به صورت سیاه و سفید می باشند ]۳۷[.
قراردادن اسیدهای نوکلئیک در معرض نور UV باید به سرعت انجام گیرد و اطلاعات مربوطه ثبت شود، زیرا اسیدهای نوکلیئک با قرار گرفتن طولانی مدت در نور تخریب شده و وضوح باندها ازبین خواهد رفت ]۳۷[.
در این طرح، پس از حرکت و ایجاد باند DNA ، ژل را از تانک الکتروفورز خارج کرده و به اتاق Gel Doc منتقل می گردد و درون ظرف رنگ آمیزی DNA STAIN قرار و مدت زمان ۳۰ دقیقه زمان داده می شود. رنگ مذکور و مورد استفاده در این طرح ، سمی نبوده و پس از رنگ آمیزی نیاز به شستشوی ژل نمی باشد. پس از ۳۰ دقیقه ژل داخل دستگاه UV Trans luminator قرار داده و تصاویر باندها مشاهده می شود و برای ثبت آن، تصاویر سیاه و سفید گرفته و چاپ می گردد.
۳-۳-۷- تعیین توالی محصولات PCR (Sequencing )
روش تعیین توالی اولیه ای که برای ژنوم انسان و بسیاری از ژنوم های دیگر به کار برده شد، روش Sanger یا خاتمه زنجیره است که برای اولین بار در اواسط دهه ۱۹۷۰ توسط Fred Sanger ارائه گردید. این شیوه براساس مهار تصادفی طویل شدن زنجیره استوار است که بدین طریق رشته های DNA جدید سنتز شده با طول های گوناگون ایجاد می شوند که بر حسب اندازه قابل تفکیک است.
در روش پیشرفته ی امروزی، تعیین توالی به صورت خودکار توسط دستگاه انجام می گیرد. دستگاه های تعیین توالی خودکار DNA که در آن، DNA با بهره گرفتن از فلوئورسانس، نشان دار می شود، در اوائل دهه ۱۹۹۰ ارائه گردیدند. در این روش، از ۴ رنگ فلوئورسان متفاوت در چهار نوع واکنش مختص به باز، استفاده می شود. با انتخاب رنگ فلوئورسنت دارای طول موج نشری متفاوت، می توان هر چهار واکنش را داخل یک چاهک واحد بر روی ژل بارگذاری نمود. در طی پروسه الکتروفورز، قطعات DNA از کنار یک منبع تحریک، نظیر لیزر عبور نموده و همزمان با عبور DNA از یک نقطه ثابت در ژل، یک مانیتور سیگنال فلوئورسانس را آشکارسازی و ثبت می کند. بدین طریق یک خروجی به فرم پروفایل شدت برای هریک از فلوئوروفورهای دارای رنگ متفاوت به دست آمده و به طور همزمان اطلاعات نیز به صورت الکترونیکی ذخیره می شود ]۱[. واکنش تعیین توالی نتایج PCR این پژوهش از طریق شرکت “دانا ژن پژوه” به کشور کانادا ارسال و تعیین توالی گردید.
فصل چهارم:
نتایج
۴-۱- بررسی نمونه ها