Primer F1+R1 (10µM)

۱

 

Primer F2+R2 (10µM)

۵/۱

 

dNTPs(10mM)

۵/۰

 

DNA Taq polymerase(5u/ µl)

۵/۰

 

جمع

۲۳

 

 

 

۱۱-۲-۳- انجام واکنش PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز ۱ و ۲

پس از آماده ­سازی مخلوط اصلی^[۵۳] در کنار یخ و انجام یکبار سانتریفیوژ کوتاه­مدت (به اصطلاح spin) به هر میکروتیوب ۵/۰ میلی لیتری واکنش PCR، ۲۳ میکرولیتر از مخلوط اصلی همگن شده، اضافه می­شد. سپس با اضافه­کردن DNA استخراجی (مربوط به نمونه‌هایی که مقاومت دارویی چندگانه داشتند) به میزان ۲ میکرولیتر به هر واکنش، میکروتیوب­ها آماده قرار گرفتن در دستگاه ترموسایکلر می­شدند. لازم به ذکر است در هر سری واکنش کنترل مثبت و کنترل منفی در کنار دیگر نمونه­ها گذاشته می­شد تا ارزش نتایج حاصل از PCR قابل اعتماد باشد. در پایان به تمامی میکروتیوب­های PCR روغن معدنی (mineral oil) اضافه­شده تا از تبخیر محلول همگن جلوگیری شده و ترکیب واکنش به هم نخورد. پس از آماده ­سازی و اطمینان از بسته­بودن درب تمامی نمونه­ها، آنها در دستگاه ترموسایکر بایوراد^[۵۴] که از قبل برنامه خاص واکنش PCR به آن داده­ شده، قرار می­گرفتند.

۱۲-۲-۳- الکتروفورز روی ژل آگارز

جدول ۱۳-۳: تهیه بافر TAE 50 بار به شرح ذیل صورت می­پذیرد

 

۲۰cc

۰٫۵ M, pH=8.3))EDTA

 

۱۱٫۴۲cc

Acetic Acid

 

۴۸٫۴۴g

Tris Base

 

۱۰۰cc

آب مقطر(D.W)

 

پس از آنکه pH، با pH­سنج روی ۳/۸ تنظیم گردید، حجم نهایی با آب مقطر به ۲۰۰ میلی­لیتر رسانده می­ شود.

 

 

محصول PCR به دست ­آمده تا زمان انجام این مرحله در دمای ۲۰- نگهداری ­شد. الکتروفورز روشی است که منجر به حرکت مولکول­های باردار در میدان الکتریکی ثابت می­ شود. الکتروفورز ژل آگارز روش استاندارد، جهت بررسی، تفکیک و شناسایی قطعات DNA می­باشد. برای انجام الکتروفورز میزان مورد نظر از پودر آگارز در بافر ۱X TAE حل می­ شود. برای الکتروفورز محصول PCR غلظت ۵/۱ درصد آگارز استفاده شد. ۱X TAE که محلول کار^[۵۵] است از محلول استوک ۵۰X TAE بدست می‌آید به این صورت که محلول استوک با نسبت ۱به ۴۹ با آب مقطر رقیق می‌شود تا محلول کار حاصل شود. روش تهیه بافر TAE 50 بار غلظت به­شرح جدول (۱۳-۳) می­باشد.
محلول شدن پودر آگارز در حلال (TAE 1X) با بهره گرفتن از حرارت ماکروویو و هم­زدن مداوم انجام شد، تا محلول آگارز کاملا شفاف گردید. پس از سرد شدن و رسیدن به دمای حدود ۵۰-۴۰ درجه سانتی ­گراد و برای مرئی شدن قطعات DNA زیر نورUV اتیدیوم بروماید (۷ میکرولیتر به ازای هر ۱۰۰ میلی لیتر ژل) افزوده شد و پس از مخلوط نمودن آن، به درون قالب­های مخصوص دستگاه الکتروفورز انتقال داده ­شد بطوریکه ضخامت آن ۵ میلی­متر باشد. پس از انجماد کامل ژل آگارز، با برداشتن شانه، چاهک­های محل استقرار نمونه­های DNA پدیدار می­ شود. قالب مذکور که حاوی ژل آگارز تهیه شده می­باشد به تانک الکتروفورز منتقل شد. بافر موجود در تانک (TAE 1X) بایستی به میزانی باشد که سطح آگارز را بپوشاند.