چکیده:
سرطان کولون یکی از شایعترین علل مرگ و میر ناشی از سرطان در سراسر جهان میباشد.تاکنون تحقیقات گسترده ای بر روی علت ها و نحوه تشکیل و گسترش سرطان روده و همینطورروش های پیشگیری و درمان آن صورت گرفته است.داروهای ضد التهابی و شیمیایی درمانی از جمله این درمان ها می باشد.سیاه دانه از گیاهان واجد خواص دارویی بسیار می باشد و تحقیقات گسترده ای نیز بر روی خواص آن صورت گرفته است.در این تحقیق سعی گردیده است تا با اضافه نمودن دانه کامل سیاه دانه به خوراک رت های تحت تحقیق تاثیرات پیشگیرانه ضد سرطان این گیاه مورد ازریابی قرار گیرد.
در این تحقیق ۵۰ سر موش رت در ۶ گروه کنترل مثبت،تیمار سیاه دانه ۲%،تیمار سیاه دانه۴%،کنترل منفی،شم سیاه دانه۲% وشم سیاه دانه۴% مورد تزریق کارسینوژن دی متیل هیدروزاین به مدت ۱۸ هفته قرار گرفتند.۱۲ هفته بعد از آخرین تزریق رت ها تیمار و نگهداری شده، سپس کالبد گشایی و نمونه گیری از روده ها صورت گرفت..ازطرفی از هر رت خونگیری شد ونمونه ای از کبد و کلون تهیه شد وسپس هموژن گردید و از لحاظ پارامتر های بیوشیمیایی (GSH,GST ,سیتوکروم P-450و پروتئین بتاکاتنین)مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایجی که در این بررسی به دست آمد نشان داد که سرطان زایی و ایجاد تومور در گروه کنترل مثبت نسبت به کنترل منفی واجد اختلاف معنی دار بود و القاء سرطان به خوبی صورت گرفت.بررسی گروه تیمار سیاه دانه ۲%و۴% و مقایسه با گروه های کنترل مثبت نشان داد که علی رغم وجود روند کاهش ضایعات توموری اختلاف معنی داری دراندازه و تعدادتومورها و ضایعات میکروسکوپی بین گروه های فوق موجود نمی باشد. بررسی تغییرات در سیستم متابولیزه کننده زنوبیوتیک ها در رتهای تحت تیمار با سیاه دانه این فرضیه را تقویت می کند که احتمالا با توجه به کاهش تعداد تومورها در بافت کولون، سیستم متابولیزه کننده زنوبیوتیک ها بیشتر تحت تاثیر سیاه دانه قرار می گیرند. نتایج این تحقیق نشان می دهد که تزریق DMH منجر به افزایش میزان پروتئین بتاکاتنین در بافت کولون می شود و تغذیه رت ها با غذای حاوی ساه دانه در هر دو منجر به کاهش سطح پروتئین بتاکاتنین و برگشت آن به سطح کنترل می گردد. این نتایج نشان می دهد که تیمار رت ها با غذای حاوی سیاه دانه منجر به تعدیل فعالیت آنزیم های دخیل در متابولیسم DMH می شود که این اثر در مرحله بعد باعث کاهش بیان ژن بتاکاتنین و ممانعت از تجمع پروتئین بتاکاتنین در سلول‌های اپی‌تلیال بافت کولون می گردد.
واژگان کلیدی:سرطان کولون،سیاه دانه،دی متیل هیدروزاین، GSH,GST ,سیتوکروم P-450 , پروتئین بتاکاتنین
فصل اول
کلیات
مقدمه وهدف:
سرطان کولورکتال یکی از شایعترین علل مرگ و میر ناشی از سرطان در سراسر جهان می باشد. این نوع سرطان با شیوع ۸-۶ نفر در هر صد هزار نفر ، چهارمین نوع شایع سرطان و یک پنجم کل موارد سرطان ها را در ایران تشکیل می دهد.
تاکنون تحقیقات گسترده ای بر روی علت ها و نحوه تشکیل و گسترش سرطان روده و همینطور روش های پیشگیری و درمان آن صورت گرفته است.لازم به ذکر است که تشخیص در مراحل آغازین بیماری در پیشگیری و درمان آن بسیار موثراست.
ازجمله این موارد می توان به استفاده از داروهای ضد التهابی و شیمیایی درمانی اشاره کرد و حال آنکه عوارض جانبی این داروها ومقاومت سلولهای سرطانی درمقابل آن ها به شدت کاربرد انها را دراین زمینه ها را محدود می نماید. این درحالی است که با توجه به عوارض بسیار محدود داروهای گیاهی و تاثیرات شگرف آنها، بطور روز افزون مطالعه درجهت استفاده ازاین گروه ازداروها درحال گسترش می باشد.
سیاه دانه یکی ازمشهورترین گیاهانی است که در کشورهای اسلامی و شمالی افریقا به عنوان دارویی سنتی پیشینه طولانی دارد. اخیرا از طریق انجام تحیقات پیوسته بسیاری از ویژگی های دارویی این گیاه مورد شناسایی قرارگرفته است. ازجمله این ویژگی ها می توان به خواص آنتی باکتریال ،آنتی هیستامینی ،آنتی توموری و آنتی پراکسیداتیو آن اشاره نمود.
با توجه به اینکه درمان های دارویی و شیمیایی در ایران در حال انجام است اما تحقیقات در زمینه تاثیرات گیاهان دارویی بر روی کنترل و درمان این سرطان کم بوده و یا صورت نگرفته است.لذا بررسی ها و آزمایش های علمی در این مورد الزامی به نظر میرسد.
طی این تحقیق قصد بر ان است که از طریق سنجش ضایعات سرطانی درکولون وارزیابی آنزیم های دخیل در متابولیسم (DMH) وسطح بیان پروتئین بتا کاتنین در سلول های کلون میزان تاثیرات پیشگیرانه سیاهدانه در بروز سرطان کولون ارزیابی شود.

۱-۱- عوامل طبیعی پیشگیری کننده از سرطان

سرطان یکی از شایع‌ترین علل مرگ و میر در جوامع امروز است. روش‌های مختلفی برای درمان سرطان وجود دارد و انواع مختلفی از سرطان به خصوص سرطان کولورکتال با جراحی درمان شده اند به طوری که طول عمر ۷% از آن‌ ها حدود ۵ سال افزایش یافته است. به جز جراحی، روش‌های درمانی دیگری نظیر رادیوتراپی، ایمونوتراپی، ژن‌تراپی و همچنین شیمی درمانی برای درمان سرطان به کار گرفته می شوند، ولی متأسفانه مقاومت دارویی سلول‌های سرطانی به داروهای مختلف و عوارض ناشی از مصرف اینگونه داروها، موفقیت درمان این بیماری را به شدت کاهش می‌دهد (۱۵). با توجه به این عوامل، توجه به گیاهان دارویی و اجزاء فعال بیولوژیکی آنها در سال‌های اخیر افزایش چشمگیری داشته است. مطالعات اپیدمیولوژیک نشان داده‌اند که مصرف بالای میوه‌جات و سبزیجات با کاهش مرگ و میر ناشی از سرطان کولورکتال ارتباط دارد. امروزه گیاهان دارویی در درمان بیماری‌های مختلفی از جمله انسدادها، اختلالات تنفسی، ناراحتی‌های پوستی، بیماری‌های قلبی و اختلالات عصبی ـ روانی مورد استفاده قرار می‌گیرند. با توجه به فعالیت قوی ضدتوموری گیاهان دارویی، امروزه امکان کاربرد اینگونه داروها در پیشگیری از سرطان بسیار مورد توجه قرار گرفته است. متأسفانه برخلاف مطالعات اپیدمیولوژیکی، مطالعات آزمایشگاهی بسیار کمی در مورد اثرات مصرف میوه‌جات و سبزیجات در سرطان کولورکتال صورت گرفته است. با این وجود پیشگیری از سرطان با عوامل طبیعی، یک راه مؤثر برای کاهش ابتلا به سرطان شناخته شده است. مطالعات مختلف نشان داده‌‌اند که عوامل مهارکننده طبیعی سرطان از جمله گیاهان دارویی، دارای اثرات درمانی قابل توجهی بر روی روند سرطانزایی هستند .

جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت abisho.ir مراجعه نمایید.

۱-۲- اثر منوترپن‌های رژیمی در جلوگیری و درمان سرطان

ترکیبات بیوشیمیایی موجود در گیاهان دارویی از جمله آلکالوئیدها، ترکیبات فنولی، فلاوونوئیدها، اسانس‌ها، تانن ها و ویتامین‌ها مسئول خواص فارماکولوژیکی این گیاهان می باشد و پس از مصرف، اثرات مختلفی را در بدن ایجاد می‌کنند. از بین ترکیبات موجود در گیاهان، اسانس[۱] مسئول بسیاری از خواص فیزیولوژیکی گیاهان می باشد که به عنوان دارو و یا بخشی از دارو مورد استفاده قرار می‌گیرد. اسانس، مخلوطی از ترکیبات لیپوفیل و ترکیبات فرار است که غالباً شامل مونو و سسکوئی‌ترین‌ها، فنل‌ها و فنیل‌اترها می‌باشند و توسط تقطیر با بخار و جداسازی روغن غیرمحلول در آب از فاز آبی به دست می‌آیند. این فاز با روغن‌های چرب غیرفرار از جمله تری گلیسریدها متفاوت است. خواص پزشکی اسانس گیاهان مختلف در مطالعات گوناگون گزارش شده است (۲۳).
۱-۲-۱ بیوشیمی منوترپن‌ها
منوترپن‌ها ترکیبات رژیمی غیرمغذی موجود در اسانس گیاهان مختلف می‌باشند. این ترکیبات غالباً مسئول بو و عطر[۲] بسیاری از گیاهان می‌باشند. این ایزوپرنوئیدهای ۱۰ کربنه از مسیر موالونات در گیاهان ساخته شده و توسط PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران، قارچ ها و دیگر موجودات سنتز نمی‌شوند (۶).
۱-۲-۲-فعالیت ضدسرطانی مونوترپن‌ها
مقداری از مونوترپن‌های رژیمی دارای فعالیت ضدتوموری هستند. بطوریکه نه تنها از تشکیل و یا پیشرفت تومورهای سرطانی جلوگیری می‌کنند، بلکه تومورهای بدخیم موجود را نیز کاهش می‌دهند. لیمونن یکی از مونوترپن های موجود در اسانس گیاهان است که فعالیت ضد سرطانی آن بر علیه بسیاری از انواع سرطان ها شناخته شده است. لیمونن باعث جلوگیری از رشد نئوپلاسم‌های خود به خودی در موش‌هایی که دوز ۱۲۰۰ میلی گرم به ازای کیلوگرم وزن بدن لیمونن رژیمی را به صورت خوراکی دریافت کرده‌اند می‌شود. همچنین لیمونن رژیمی باعث کاهش وقوع لیمفوماهای خود به خودی در موش‌های می‌شود . استفاده خوراکی از لیمونن خالص یا به عنوان روغن پوست پرتقال (لیمونن ۹۵%) در جوندگان، باعث جلوگیری از رشد تومورهای القاء شده PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)، پوست، کبد، ریه و قسمت ابتدایی معده می‌گردد [۴]. Kawamori در سال ۱۹۹۶ گزارش کرد که رشد ACF (Aberrant crypt foci) القاء شده توسط آزوکسی متان در کولون رت‌هایی که ۵/۰% لیمونن را در آب نوشیدنی مصرف کرده‌اند، کاهش می‌یابد . استفاده از کاروون[۳] قبل از القاء تومور توسط کارسینوژن، نیز از رشد تومورهای معده و ریه جلوگیری می‌کند(۳۶). به علاوه، کاروئول[۴] و منتول[۵] به صورت ۱% کل رژیم غذایی از رشد تومورهای القاء شده توسط DMBA[6] در PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است) رت در مراحل اولیه جلوگیری می‌کنند (۵). استفاده از ژرانیئول[۷] (یک مونوترپن حلقوی رژیمی) قبل و بعد از پیوند[۸] سلول‌های توموری در رده‌های سلولی ملانوما، هپاتوما و لوسمیای رت‌ها (در in vitro) خاصیت ضد سرطانی دارد . به علاوه، پریلیل الکل[۹]، در فاز ارتقاء[۱۰] سرطان کبد القاء شده توسط کارسینوژن در رت، اثرات ضد سرطانی دارد ..
۱-۲-۳-مکانیسم عمل مونوترپن‌ها در جلوگیری از سرطان
ترکیباتی که دارای خاصیت ضد سرطانی هستند از نظر مکانیسم عمل به دو دسته تقسیم
میشوند: ترکیباتی که در دسته بلوکه‌کننده سرطان[۱۱] و یا دسته متوقف‌کننده فعالیت[۱۲] جای می گیرند. دسته اول در طول فاز شروع[۱۳] مراحل سرطانزایی دخالت کرده و با واکنش‌های مختلفی از جمله تغییر متابولیسم کارسینوژن و تبدیل آن به فرمی که کمتر سمی‌ است، مانع میانکنش کارسینوژن‌های شیمیایی با DNA می‌شوند. از سوی دیگر، دسته دوم در طول فاز ارتقاء از مراحل سرطانزایی عمل کرده و مانع رشد سلول‌های سرطانی می‌شوند.
اثرات ضد سرطانی بلوکه‌کننده لیمونن و دیگر مونوترپن‌ها در طول فاز شروع سرطان PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)، از طرق القاء آنزیم‌های متابولیزه‌کننده فاز I و II کارسینوژن‌ها و سم‌زدایی آنها می‌باشد (۶). دزهای ضدسرطانی لیمونن باعث القاء سیتوکروم P450 توتال، و ایزوآنزیم‌های CYP2B1 و CYP2C می‌شوند .. لیمونن و سربررول[۱۴] باعث القاء آنزیم اپوکسی هیدراتاز نیز می‌شوند . مطالعه‌ای نشان داده است که متابولیسم DMBA در رت‌هایی که لیمونن و سربررول دریافت کرده‌اند، افزایش یافته و DMBA بیشتری از ادرار دفع می‌شود. این امر احتمالاً به دلیل القاء آنزیم‌های گلوتاتیون S ـ ترانسفراز و UDP ـ گلوکورونیل ترانسفراز توسط منوترپن‌های مذکور می‌باشد. در این مطالعه نشان داده شده است که اتصال DMBA-DNA در اثر مصرف مونوترپن‌ها کاهش یافته است .
اثرات ضدسرطانی متوقف‌کننده مونوترپن‌ها در طول فاز پیشرفت مراحل سرطانزایی در سرطان PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است) و کبد ممکن است به دلیل جلوگیری از تکثیر سلول‌های توموری، تسریع در مرگ سلول‌ها و یا القاء تمایز سلول‌های توموری باشد .. فعالیت ضدسرطانی پریلیل الکل در طول فاز پیشرفت مراحل سرطانزایی کبد با افزایش قابل توجهی در مرگ سلول‌های توموری توسط آپوپتوز می‌باشد . بسیاری از مونوترپن‌ها از جمله لیمونن، پریلیل الکل و متابولیت‌های سرمی فعالشان، مانع ایزوپرنیلاسیون پروتئین‌ها می‌شوند. پروتئین‌های پرنیله شده شناخته شده PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران شامل پروتئین‌های کوچک متصل‌شونده به GTP وابسته به Ras [۱۵] پروتئین‌های هتروتریمر و لامین‌های هسته‌ای می‌باشند. پرنیلاسیون Ras آن را قادر می‌سازد تا با غشای پلاسمایی ارتباط برقرار کند که این ارتباط برای فعالیت انکوژنی Ras لازم می‌باشد. بسیاری از پروتئین‌های پرنیله، رشد و یا ترادیسی[۱۶] سلولی را تنظیم می‌کنند و تأثیر مونوترپن‌ها بر روی پرنیلاسیون یک و یا تعدادی از این پروتئین‌ها فعالیت ضد توموری آنها را توجیه می‌کند. اگرچه مطالعات نشان داده‌اند که پروتئین Ras تنها آنکوژن‌ متأثر از منوترپن‌ها نمی‌باشد و پرنیلاسیون بسیاری از پروتئین‌ها غیر از Ras از جمله پروتئین‌های پرنیله TC21، Rho و تیروزین فسفاتازهای PRL-1/PTPCAAX نیز در بسیاری از رده های سلولی تحت تاثیر قرار می گیرد ..
به طور خلاصه، انواع مختلفی از مونوترپن‌های رژیمی در پیشگیری و یا درمان سرطان مؤثر هستند. مونوترپن‌ها دارای خصوصیات ایده‌آل یک عامل ضدسرطانی از جمله فعالیت ضدتوموری، دسترسی آسان، قیمت پایین، زیست دسترسی خوراکی و مسمومیت پایین بوده و بدین ترتیب آنها را به عنوان عوامل ضدسرطانی خوب و ایده‌آل معرفی می‌کند (۶). مطالعه‌ای در سال ۲۰۰۶ نشان داده است که اسانس‌ برخی از گیاهان دارویی از رشد و تمایز سلول‌های اریترولوکمیا K562 انسانی جلوگیری می‌کنند . مصرف خوراکی BNF[17] در دوز ppm50 به مدت یک هفته در رت‌های مدل سرطانی کولون القاء شده توسط DMH [۱۸] (۲۰ میلی گرم به ازای کیلوگرم وزن) باعث افزایش فعالیت CYP در کولون شده ولی روی سطح GSH و GST اثری نداشته است. در کبد CYP تغییری نداشته ولی GSH و GST افزایش یافته‌اند .
مطالعه‌ای نشان داده است که کاروون و لیمونن و مشتقات آنها دارای اثرات ضدسرطانی در رده سلولی سرطان پروستات (LNCap cells) می‌باشند. این ترکیبات از رشد سلول‌ها جلوگیری کرده و موجب فعالسازی ERK و القاء P21 می‌شوند . مصرف خوراکی سیاه دانه[۱۹] (۲۰۰ میلی گرم به ازای کیلوگرم وزن) به رت‌های تیمار شده با DMH (20 میلی گرم به ازای کیلوگرم وزن) به مدت ۱۴ هفته، باعث کاهش تعداد ACF در کولون رت‌ها گردیده است. همچنین این گیاه دارو بدون اینکه هیچگونه اثرات جانبی به همراه داشته باشد، باعث کاهش رشد و تکثیر سلول‌های سرطانی در این حیوانات می گردد .
تیمار رده سلولی گلیومای رت و انسان با bisabolol ـ α (یک الکل سزکوئی ترپن که در اسانس‌های روغنی طبیعی موجود است) پس از ۲۴ ساعت باعث مرگ و میر سلول‌های مذکور گردیده است. این مطالعه بیان می‌کند که افزایش مرگ و میر این سلول‌ها به دلیل شکست poly (ADP-ribose) polymerase و در نتیجه آپوپتوز سلول‌ها می‌باشد. همچنین اتلاف پتانسیل بین غشایی میتوکندری و آزادسازی سیتوکروم C از میتوکندری نشان می دهد که در این سلول‌های گلیوما، آپوپتوز از یک مسیر داخلی اتفاق افتاده است. ترکیبات اسانس ریشه گیاه yerba mansa (یک گیاه در آمریکای شمالی) در غلظت‌های مختلف باعث کاهش رشد و تکثیر رده سلولی Hela و AN3CA در in vitro گردیده است .غلظت ۲۰ و ۳۰ میلی گرم در هر میلی لیتر از Cymbopogon flexuosus و ترکیب شیمیایی سزکوئی ترپن ایزواینترمدئول باعث مهار تکثیر رده سلولی لوکمیای انسانی (HL-60) می‌شود. با بررسی مسیرهای مختلف آپوپتوز و عوامل دخیل در این مسیر از جمله مسیرهای وابسته به میتوکندری، مشخص گردید که این ترکیبات باعث آپوپتوز سلول‌ها از مسیر داخلی و خارجی می‌گردند. به علاوه این مواد باعث جابه‌جایی Bax و کاهش بیان NF-kB می‌گردند .
تزریق اسانس سیاه دانه در دوز ۵۰ و ۳۰ به جایگاه توموری القاء شده توسط P815cells در موش‌ها باعث مهار رشد و نمو تومور گردیده است. همچنین در این مطالعه، گسترش متاستاز کبدی کاهش پیدا کرده و طول عمر موش‌ها افزایش داشته است (۱). ژرانیول در دز mM 150 باعث کاهش شدید بیان ژن تیمیدیلات سنتاز و تیمیدین کیناز در سلول‌های سرطانی کولون SW620 و CaCo-2 و در نهایت توقف رشد آنها می‌شود. بررسی in vitro در این مطالعه نیز نشان داده است که ژرانیئول باعث کاهش مقاومت سلول‌های سرطانی موش القاء شده توسط TC-118 cells به داروی ۵ـ فلوئورواوراسیل و افزایش مهار رشد تومور توسط این دارو می‌گردد. این ترکیب همچنین طول عمر حیوانات را افزایش می‌دهد . اسانس گیاه Zanthoxylum schinifolium وابسته به دز با افزایش تولید Ros، باعث افزایش آپوپتوز در رده سلولی هپاتومای انسانی HepG2 می‌گردد.
اسانس گیاه Sandalwood باعث کاهش تعداد پاپیلوماهای پوستی القاء شده توسط TPA در موش می‌شود. این ماده همچنین باعث کاهش فعالیت آنزیم اورنیتین دکربوکسیلاز در این حیوانات می‌گردد (۹). تیمار موش‌های C57BL/6 با مونوترپن‌هایی نظیر لیمونن (mol/kg b.w μ۱۰۰) و perillic acid (mol/kg b.w μ۵۰) باعث کاهش قابل ملاحظه‌ای در تعداد تومورهای متاستاتیک ریه القاء شده توسط سلول‌های ملانومای B16F-10 می‌گردد. این نتایج با کاهش پارامترهای بیوشیمیایی نظیر سیالیک اسید سرم، هیدروکسی پرولین کلاژن ریه و اورونیک اسید در گروه‌های تیمار، مطابقت دارد.
تیمار رده سلولی ملانوما با Terpinen-4-ol در غلظت‌های ۰۰۵/۰ و ۰۰۳/۰ درصد مانع رشد این سلول‌ها گردیده است. نتایج تحقیق فوق نشان می دهند که نشان می‌دهند که Terpinen-4-ol باعث القاء مسیرهای وابسته به caspase آپوپتوز سلول‌های ملانوما می‌گردد .

۱-۳-مروری کلی بر سرطان و عوامل دخیل در آن

سرطان پس از بیماری‌های قلبی عروقی دومین علت شایع مرگ و میر در جهان می باشد. میزان بروز بسیاری از انواع سرطان با افزایش سن، چهار تا شش برابر افزایش می‌یابد. سلولهای سرطانی را با سه ویژگی توصیف می‌کنند:
۱ـ کاهش یا فقدان کنترل رشد
۲ـ تهاجم به بافت‌های اطراف
۳ـ گسترش یا متاستاز به قسمت‌های دیگر بدن
کنترل رشد در سلولهای تومورهای خوش‌خیم نیز کاهش می‌یابد؛ اما این سلولها به بافتهای اطراف حمله نکرده و به قسمتهای دیگر بدن نیز گسترش نمی‌یابند (۲۶) فرایند ایجاد سرطان (کارسینوژنز) حداقل دارای سه مرحله شروع[۲۰]، ارتقاء[۲۱] و پیشرفت [۲۲] می باشد .(شکل ۱-۱)

شکل ۱-۱٫ مراحل ایجاد سرطان
فاز شروع: شامل یک موتاسیون غیرکشنده[۲۳] در DNA‌ بوده که پس از حداقل یک بار سنتز DNA، این آسیب ژنتیکی تثبیت می‌ِشود.
فاز ارتقاء: در این مرحله سلولهای مرحله قبلی توسط القاء تکثیر سلولی و مهار آپوپتوز توسعه پیدا می کنند. این مرحله برگشت‌پذیر بوده و به ادامه حضور تحریک توسط یک عامل محرک بستگی دارد.
فاز پیشرفت: آخرین مرحله کارسینوژنز و برگشت‌ناپذیر است. در این مرحله آسیب‌های ژنتیکی بیشتری رخ می‌دهد که منجر به انتقال سلول از یک حالت خوش‌خیم[۲۴] به فنوتیپ بدخیم[۲۵] می‌شود (۲۰).
عوامل ایجادکننده سرطان (کارسینوژن) را به سه گروه اصلی ۱ـ انرژی تابشی ۲ـ ویروسها ۳ـ ترکیبات شیمیایی تقسیم می‌کنند. به طور کلی این عوامل از طریق ایجاد جهش در ژنها یا آسیب به DNA اثر خود را اعمال می‌کنند (۲۶). کارسینوژن‌های شیمیایی به دو دسته ژنوتوکسیک[۲۶] و غیر ژنوتوکسیک[۲۷] (یا اپی ژنیک[۲۸] ) تقسیم شده و در مراحل مختلف کارسینوژنز شرکت می‌کنند. عوامل ژنوتوکسیک ترکیبات شیمیایی هستند که به صورت مستقیم به DNA آسیب زده که منجر به موتاسیون و یا تغییرات کلاستوژنیک می‌ِشوند، بنابراین در مرحله شروع دخالت می‌کنند. عوامل غیرژنوتوکسیک یا از طریق واکنش غیرمستقیم روی DNA و یا از طریق واکنش روی مولکول‌های غیر از DNA عمل می‌کنند. این عوامل در مرحله ارتقاء دخالت داشته و باعث تغییر در بیان ژن، رشد و مرگ سلولی می‌گردند(۲۰).
تشکیل تومور و متاستاز آن، در اثر موتاسیون‌های ژنتیکی مختلفی به وجود می‌آید. یک سلول منفرد، در اثر موتاسیون، کنترل چرخه سلولی، تمایز و آپوتپوز را از دست می دهد و توان تکثیری آن از یک سلول طبیعی فراتر می رود. تکثیر کنترل نشده سلول، منجر به اجتماع سلول‌های جهش یافته و در نهایت نیازمند رگزایی می گردد. رشد تومور، همچنین با تهاجم بافتی و متاستاز به ارگان‌های دیگر دنبال می‌شود.
تا کنون بیش از صد نوع سرطان شناخته شده است. البته هر کدام از آنها نیز خود به انواع مختلفی تقسیم می‌شوند، اگرچه بطور کلی، دو دسته اصلی ژن، انکوژن‌ها و ژنهای سرکوبگر تومور، در مرحله آغازین تومور دخیل هستند، اما تشخیص و طبقه‌بندی کل تعداد ژن‌ها و مسیرهایی که در تشکیل سرطان‌های مختلف دخالت دارند امکان‌پذیر نمی‌باشد. علاوه بر جهش ژن‌های مختلف و مسیرهای متفاوتی که در تشکیل تومورهای مختلف دخیل هستند. تغییرات اپی ژنتیکی نیز در طول مراحل سرطانزایی رخ می دهد و به پیشرفت روند سرطان کمک می‌کنند (۳۱).
۱-۳-۱انکوژن‌ها و ژن های سرکوبگر سرطان[۲۹]
پروتوآنکوژن‌ها مسئول تکثیر کنترل شده سلولی و تمایز آن هستند. به دلیل غالب بودن ژن پرتوآنکوژن‌ها، جهش در یک آلل از این ژن ها منجر به تکثیر کنترل نشده سلولی می گردد. موتاسیون انکوژن‌ها با افزایش مقدار محصول ژنی یا تغییر عملکرد ژن همراه می‌باشد.
تاکنون بیش از صد انکوژن مختلف شناخته شده است که به عنوان فاکتورهای رشد، رسپتورهای فاکتور رشد، فاکتورهای پیام‌رسانی داخل سلولی، پروتئین‌های هسته‌ای متصل‌شونده به DNA و فاکتورهای سیکل سلولی عمل می‌کنند (۱۰).
سه کلاس از تومور ساپرسورژن‌ها شناخته شده‌اند: gatekeepers، caretakers و landscapers. موتاسیون دسته اول شامل ژن های مهارکننده‌های تکثیر سلولی یا ژن‌های تسریع آپوپتوز هستند و موتاسیون آنها برای تشکیل تومور ضروری است. کمبود دسته دوم از جمله ژن‌های ترمیم DNA، منجر به ابقاء ژن‌های موتانت و در نتیجه ایجاد و پیشرفت سرطان می‌شود. موتاسیون دسته سوم باعث تغییر خصوصیات تومور می‌شود. پیشرفت تومور نیاز به غیر فعال شدن هر دو آلل، تومور ساپرسور ژن‌ها در بافت هدف دارد که به عنوان مدل دو ضربه‌ای Knudson (s two hit model’Knudsonn) نامیده می‌شود. (۱۰).
۱-۳-۲-مکانیسم‌های اپی ژنتیک
نه تنها تغییرات ژنتیکی بلکه تغییرات اپی ژنتیکی نیز در طول فرایند کارسینوژنز روی می‌دهند. استیلاسیون، داستیلاسیون و متیلاسیون هیستون‌ها و برخی از ژن‌ها از جمله مکانیسم‌های اپی ژنتیک می‌باشند (۱۷).
هایپرمتیلاسیون مناطق CpG، باعث ایجاد فنوتیپ متیله در مناطق CpG می‌گردد که در سرطان کولورکتال (CRC) بسیار دیده می‌شود. هایپرمتیلاسیون DNA به تنهایی و یا همراه با تغییرات ژنتیکی منجر به غیرفعال شدن ژن های سرکوبگر سرطان می‌شود (۱۰). در حدود ۷۰% بازهای سیتوزین که به صورت کووالانسی به گوانین متصل هستند با متیلاسیون و سپس دآمیناسیون تبدیل به تیمین می‌شوند . عدم ترمیم این اختلال باعث تغییر توالی ژن و ایجاد آسیب‌های سرطانزا در DNA می‌شود.
از لحاظ فیزیولوژیکی، متیلاسیون DNA در مناطق CpG Islands برای رشد و نمو PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران ضروری است و باعث ایجاد عملکردهای فیزیولوژیکی گوناگونی از جمله تغییر رونویسی، عدم تحرک ترانسپوزون‌ها و تغییر بیان ژن‌ها در بافت‌های مختلف می‌گردد. همچنین بسیاری از تومور ساپرسورژن‌های کلیدی که مسئول ایجاد سرطان های مختلف هستند با هایپرمتیلاسیون CGI غیر فعال می‌شوند.

۱-۴ سرطان کولورکتال (CRC)[30]

سرطان کولورکتال، یکی از شایعترین بیماری ها در بین جمعیت‌های امریکایی و اروپای غربی بوده و همچنین یکی از علل مرگ و میر و ناتوانی ناشی از سرطان در سراسر جهان می‌باشد. در امریکا سالانه حدود ۰۰۰/۱۴۰ مورد جدید و ۰۰۰/۵۰ مرگ (۳۵) و در اروپا سالانه در حدود ۰۰۰/۲۱۳ مورد جدید و ۰۰۰/۱۱۰ مرگ ناشی از CRC گزارش می‌شود.
سرطان کولورکتال دومین علت مرگ و میر در ایالات متحده امریکا می‌باشد (۱۴). در سال ۲۰۰۴، حدود ۰۰۰/۱۰۰ مورد جدید و ۵۷۰۰۰ مرگ ناشی از این بیماری در امریکا گزارش شده است (۱۶). میزان شیوع CRC در مناطق جغرافیایی مختلف، متفاوت می‌باشد. شیوع این بیماری در آسیا، افریقا و مناطقی از امریکای لاتین کم بوده و در کشورهای غربی شامل اروپای شمالی، استرالیا، نیوزلند و امریکا، بالا می‌باشد (۲۷). مطالعات گوناگون در جمعیت‌های مهاجر نشان داده‌اند که جمعیت‌هایی که از مناطق کم خطر به مناطق پرخطر مهاجرت کردند، سریعاً ریسک ابتلا به سرطان را به دست آورده‌اند و این امر نشان دهنده نقش عوامل محیطی و منطقه‌ای در استعداد ابتلا به CRC می‌باشد. تقریباً ۵۰% جمعیت غربی از CRC رنج می‌برند و این بیماری هم در زنان و هم در مردان شایع است (۲۲).
سرطان کولورکتال با میزان ۸ـ۶ در هر ۰۰۰/۱۰۰ نفر، چهارمین نوع شایع سرطان در ایران می‌باشد. بروز زودهنگام این بیماری (کمتر از ۴۰ سال) باعث شده است که CRC یک پنجم کل موارد سرطان را در کشور تشکیل ‌دهد. شاید یکی از دلایل درصد بالای بیماران جوان مبتلا به CRC در ایران، ساختار سنی جوان این کشور و نیز شیوع کمتر این بیماری در افراد مسن می‌باشد (۲۴).
۱-۴-۱-علت‌های بروز سرطان کولورکتال (۷)
از سال‌ها پیش مشخص شده است که فاکتورهای رژیمی، محیطی و نیز فاکتورهای ژنتیکی، نقش خیلی مهمی را در بروز CRC، ایفا می‌کنند. فاکتورهای رژیمی و عوامل محیطی در بروز CRC اسپورادیک و فاکتورهای ژنتیکی در بروز CRC ارثی دخیل هستند. رژیم غربی که شامل چربی و گوشت قرمز فراوان می‌باشد، فاکتور خطر خیلی مهمی برای شروع CRC می باشد. اما میوه‌جات، سبزیجات و فیبرهای رژیمی خطر ابتلا به CRC را کاهش می‌دهند (۴۲) فاکتورهای رژیمی، فلور روده‌ای و محیط داخل آن را تحت تأثیر قرار می‌دهند. در صورت مصرف رژیم غذایی غربی (غنی از چربی و گوشت)، مواد کارسینوژن و موتاژن‌ مختلفی در مدفوع دیده می‌شوند.
۱-۴-۲-مدل‌های تشکیل CRC (از آدنوما تا کارسینوما)
تخریب و نوسازی[۳۱] اپی‌تلیوم دستگاه گوارش بسیار سریع – در حدود ۳ تا۵ روز- می باشد. موکوس روده‌ای PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران توسط تکثیر فعال سلولهای بنیادی در کریپتها، مورد بازسازی قرار می‌گیرد. رشد بیشتر این سلول‌ها تا محور Crypt-villus ، باعث توقف تکثیر و سپس تمایز آنها می‌شود. بعد از آن، انتروسیت‌های متمایز شده، دچار آپوپتوز شده و به داخل مجرای گوارشی ریزش می‌کنند. عدم تنظیم تکثیر، تمایز و آپوتپوز منجر به بروز نئوپلازی دستگاه گوارش میگردد .
سرطان کولورکتال، در اثر یک سری تغییرات هیستوپاتولوژیک، که در نتیجه تغییرات ژنتیکی خاص در تعدادی از آنکوژن‌ها و تومور سوپرسور ژن‌ها ایجاد می شوند، به وجود می‌آید. حداقل ۴ تغییر ژنتیکی متوالی برای شروع CRC، مورد نیاز است (شکل ۱-۲). یک انکوژن به نام KRAS و سه تومور سوپرسورژن‌ به نام‌های APC[32] ، SMAD4 و TP53، هدف اصلی این تغییرات ژنتیکی هستند. موتاسیون ژن APC و از دست دادن عملکرد این ژن، اولین رویداد در شروع تغییرات بدخیم در روده بزرگ می‌باشد. تقریباً در ۵۰% جمعیت غربی، در حدود سن ۷۰ سالگی، نشانه‌های آدنومای روده‌ای دیده می‌شود (۴۴)
مراحل مختلفی در روند یک سرطان، از شروع آسیب‌های خوش خیم تا تومورهای متاستاتیک وجود دارد (۱۱). در شکل۲-۱، مدلی از مراحل مختلف روند پیشرفت CRC، نشان داده شده است. در این مدل، الف) تومورهای سرطان کولورکتال، در نتیجه جهش‌هایی به وجود می‌آیند که باعث فعال‌سازی انکوژن‌ها و غیرفعال شدن تومور ساپرسورژن‌ها می‌گردندب) برای ایجاد یک تومور بدخیم، ژن‌های مختلفی باید دچار جهش شوند و ج) تغییرات ژنتیکی در یک ترتیب خاص و معین روی می‌دهند.
یکی از مهمترین راه‌های مقابله با این بیماری تشخیص سریع و درمان به موقع آن است. تشخیص به موقع و درمان سریع سرطان کولورکتال به خصوص در مراحل اولیه گاهی طول عمر بیماران را تا ۹% افزایش می‌دهد. مارکرهای مختلفی برای تشخیص به موقع سرطان کولورکتال در مراحل اولیه وجود دارد. یکی از مهمترین بیومارکرها ACF[33] است که در واقع اولین تغییرات مورفولوژیکی قابل تشخیص در کولون حیوانات آزمایشگاهی تیمار شده با انواع کارسینوژن‌ها از جمله DMH می‌باشد . موتاسیون و تغییر بیان برخی از ژن‌ها در ایجاد ACF نشان‌دهنده این موضوع است که ACF در کولون جوندگان به عنوان یک مارکر بیوشیمیایی خوب در تشخیص روند سرطانزایی CRC عمل می‌کند . همچنین ACF به عنوان یک مارکر نهایی به منظور بررسی اثرات مهارکننده‌های مختلف در درمان CRC مورد بررسی قرار می‌گیرد . در روند آدنوما ـ کارسینوما، کوچکترین آسیب بافتی قابل تشخیص ACF می‌باشد. آسیبهای ACF، آسیب های کوچک بافتی با خصوصیات هیستولوژیکی مختلف، از هایپرپلازی تا دیسپلازی می باشد .که دو نوع از آن تاکنون مشخص شده است. شایعترین نوع ACF، کریپت هایپرپلاستیک یا هایپرسلولار بوده که به ندرت به کارسینومای بدخیم تبدیل می‌شود. دومین نوع آن، ACF دیسپلاستیک یا آدنومای تک کریپتی[۳۴] بوده که غالباً در کارسینومای موکوس کولون به وجود می‌آید. در اغلب ACFهای دیسپلاستیک، موتاسیون APC و در اغلب ACFهای هایپرپلاستیک غیربدخیم، موتاسیون KRAS دیده می‌شود(۴۹).