شکل۱-۵: دستگاه تقطیر و استخراج همزمان
۱-۳- ترکیبهای ضد اکسیدان
ضد اکسیدانها موادی هستند که در غلظت کم و با سازوکاری ویژه از عمل اکسایش جلوگیری می کنند ویا باعث کاهش ویا به تأخیر افتادن آن می شوند [۲۳] .
سالهای سال است که به منظور جلوگیری از تخریب مواد غذایی که به دلیل اکسایش چربیهای غیراشباع و سایر عوامل روی میدهد، ضد اکسیدانها را به فراوردههای غذایی میافزایند. به هر حال بسیاری از ضد اکسیدانهای مصنوعی که طی ۵۰ سال اخیر مورد استفاده بودهاند، برای مصرفکنندگان امروزی که به دنبال مواد غذایی هرچه طبیعیتر میگردند، دیگر قابلقبول نیستند. این امر باعث جستجو برای یافتن ضد اکسیدانهای طبیعی شد که جزء اصلی سازندهشان مواد فنلی میباشد [۵].
ویژگیهای اکسیدکنندگی اکسیژن نقش حیاتی در اعمال بیولوژیکی متفاوت مثل استفاده از غذا، انتقال الکترون برای تولید ATPدارد، در حالی که اکسیژن برای حیات ضروری است، همچنین میتواند باعث اکسید کردن مواد درون سلول شود و نقش تخریب کننده داشته باشد. اکسیژن میتواند به اشکال بسیار فعال مثل رادیکالهای سوپراکسید، رادیکالهای هیدروکسیل و هیدروژن پراکسید تبدیل شود و به این صورت میتواند به DNA آسیب برساند، یا اینکه آنزیمهای ضروری و پروتئینهای ساختاری را تخریب کند. همچنین میتواند واکنشهای زنجیرهای از کنترل خارج شده مثل واکنشهای اکسایش خود به خودی و پراکسیداسیون را برانگیزد.
پلی فنلها انواعی از ضد اکسیدانها هستند که در جلوگیری از بسیاری بیماریها از جمله سرطان نقش دارند، این ترکیبات بسیار متنوع هستند واثرات متفاوتی دارند. ترکیبات فنلی شامل ویتامینها، رنگدانهها و فلاونوئیدها، ویژگیهای ضدجهشی ودر نتیجه ضد سرطانی و همچنین فعالیت کاهش قند خون را برعهده دارند [۲۴].
–
جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت jemo.ir مراجعه نمایید.
۱-۳-۱- روش های سنجش فعالیت ضد اکسیدانی
این روشها بر دو اصل استوار است که عبارتند از:
الف) روش هایی که مبنای آن ها انتقال اتم هیدروژن است .
این سنجشها براساس توانایی ماده ضد اکسیدان برای رقابت با ماده شیمیایی مستعد اکسایش (جز مورد عمل) درانتقال اتم هیدروژن به رادیکال های آزاد ارزیابی می شود . دراین روش اغلب از یک تولید کننده رادیکال که رادیکال های پایدار با طول عمر کوتاه تولید میکند؛ استفاده می شود همچنین علاوه بر ضد اکسیدان، مولکول قابل اکسایش نیز استفاده میشود . ضد اکسیدان های اضافه شده با جز مورد عمل برای گرفتن رادیکال آزاد رقابت میکنند. از آن جایی که در بررسی ظرفیت ضد اکسیدانی عصاره از آزمایش مهار اکسایش لینولئیک اسید استفاده شد [۲۵] . دراین جا به شرح این روش پرداخته می شود.
۱-۳-۱-۱- آزمون بیرنگ شدن بتا کاروتن در حضور لینولئیک اسید[۳۲]
دراین روش لینولئیک اسید در محیط آبی اشباع از اکسیژن مولکولی (O2) اکسید شده وبه رادیکال آزاد مربوطه LOO. تبدیل می شود. این رادیکال آزاد در مرحله بعد با جذب هیدروژن اتمی (H· ) ازبتاکاروتن موجب اکسید شدن آن و زایل شدن رنگ زرد نارنجی ناشی ازآن می شود . وجود ماده ضد اکسیدان در محیط می تواند با بتاکاروتن در دادن هیدروژن اتمی رقابت نموده واز زایل شدن رنگ جلوگیری نماید . این آزمایش نمونه ای از سنجش به روش انتقال اتم هیدروژن است ودرآن میزان زوال رنگ بتا کاروتن با سنجش میزان جذب نور آن در طول موج ۴۷۰ نانومتر معین می شود [۲۶و۲۷] .
ب) روشهایی که مبنای آن ها انتقال الکترون است.
۱-۳-۱-۲- سنجش مقدار تام فنل با FCR[33]
این روش ابتدا برای پروتئینها به کار رفت واساس آن تمایل به باقی مانده تیروزین است (آمینو اسید تیروزین دارای یک گروه فنلی است.) چند سال بعد سینگلتون[۳۴] وهمکارانش این روش را برای آنالیز مقدار تام فنل در شراب به کار بردند و به تدریج این روش کاربرد زیادی پیدا کرد.
معرف فولین سیوکالتیو از جوشیدن مخلوط سدیم تنگستات (Na2WO4.2H2O) ، سدیم مولیبدات (Na2MnO4.2H2O)، اسید کلریدریک غلیظ و اسید فسفریک ۸۵% به همراه افزودن آب تهیه می شود و سپس لیتیم سولفات (li2SO4.4H2O) به مخلوط اضافه می شود تا مخلوط زردرنگ که همان معرف است؛ تهیه شود. وجود احیا کننده در محیط باعث ایجاد رنگ سبز رنگ و اضافه کردن اکسید کننده مثل برومین رنگ زرد را حفظ می کند . طبیعت شیمیایی دقیق واکنشگر FC ناشناخته است . عقیده بر این است که حاوی هتروپلی فسفو تنگستات[۳۵] است. در اثر واکنش های برگشت پذیر کاهش، گونههای آبی رنگی به وجود می آید که احتمال می رود به دلیل تشکیل ۴- (PMoW11O40 ] [ باشد. دراین روش اعتقاد براین است که مولیبدینیوم به آسانی در مخلوط احیا می شود و واکنش انتقال الکترون بین احیا کننده و مولیبدینیوم اتفاق میافتد.
Mo (VI)yellow+e Mo (V)green
معرف فولین- سیوکالتیو یک معرف غیر اختصاصی است و خیلی از ترکیب های غیرفنلی را هم احیا می کند که از معایب آن به شمار می رود. برای شناسایی ترکیب های فنلی محیط را با محلول سدیم کربنات تا PH حدود ۱۰ قلیایی میکنند؛ در ضمن واکنش پروتون فنلی تبدیل به آنیون فنلات می شود که این آنیون قادر است معرف فولین – سیو کالتیو را احیا کند وآن را به رنگ سبز درآورد. سپس به روش رنگ سنجی مقدار تام فنل سنجیده می شود. ترکیبات آبی رنگی که بین فنلات و واکنشگر FC تشکیل می شود؛ مستقل از ساختار ترکیب های فنلی است وکمپلکس بین ترکیب های فنلی وفلز مرکزی تشکیل می شود [۲۹-۲۸].
۱-۳-۱-۳- سنجش ظرفیت به دام انداختن رادیکال DPPH [۳۶]
روش ساده، سریع و ارزان برای اندازهگیری فعالیت ضد اکسیدانی که شامل استفاده از رادیکال ۲، ۲-دیفنیل -۱-پیکریلهیدازیل (DPPH) است. این رادیکال آزاد وپایدار است که می تواند یک الکترون و یا رادیکال هیدروژن قبول کند وبه یک مولکول خنثی و پایدار تبدیل شود . این ماده به دلیل دارا بودن الکترون منفرد دارای جذب قوی در طول موج ۵۱۷ نانومتر می باشد که دراین مرحله، محلول متانولی آن بنفش رنگ است . در حضور ضد اکسیدان با بهره گرفتن از این تغییر جذب می توان توانایی مولکول های مختلف را به عنوان مهار کننده رادیکال آزاد سنجید؛ درواقع میزان تغییر در جذب هرنمونه به قدرت و توانایی جاذب رادیکال بستگی دارد . احیا شدن DPPH و کاهش جذب در طول موج ۵۱۷ نانومتر در دمای اتاق و پس از گذشت ۵ دقیقه از شروع واکنش صورت می گیرد . مزیت کاربرد DPPH این است که در زمان کوتاهی می توان تعداد زیادی نمونه را اندازه گیری نمود و همچنین از حساسیت کافی برخوردار است.
نمودار صفحهی بعد احیا شدن DPPH را با یک نمونه ضد اکسیدان نشان میدهد:
نمودار ۱-۱ : نمودار جذب- طولموج برای DPPH در حضور ضد اکسیدان
جذب رادیکال DPPH در طول موج ۵۱۷ نانومتر از قانون بیر- لامبرت تبعیت می کند و کاهش میزان جذب آن با میزان ماده ضد اکسیدان رابطه خطی دارد. به عبارتی در ازای افزایش هرچه بیشتر ماده ضد اکسیدانی، DPPH بیشتری مصرف می شود و رنگ آن از بنفش به زرد می گراید. غلظتی از ضد اکسیدان که باعث کاهش ۵۰% از غلظت DPPH ابتدایی میشود با [۳۷]IC50 تعریف می شود . میزان IC50 وخاصیت ضد اکسیدانی با یکدیگر نسبت عکس دارند؛ به صورتی که هرچه میزان IC50 کمتر باشد خاصیت ضد اکسیدانی نمونه بیشتر است . این روش نقاط ضعفی هم دارد . گزارشها نشان می دهد که واکنش DPPH با اوژنول برگشت پذیر است بنابراین برای نمونه های حاوی اوژنول ودیگر فنلها با ساختاری مشابه با اوژنول ظرفیت ضد اکسیدانی را پایینتر از آنچه هست؛ نشان می دهد [۲۷ ،۳۰ و ۳۱].
۱-۴- کروماتوگرافیگازی[۳۸]
از متداول ترین روش ها برای آنالیز ترکیبات فرار گیاهی، استفاده از کروماتوگرافی گازی (GC) است. در این کروماتوگرافی نمونه تبخیر و به سر ستون کروماتوگرافی ترزیق میشود. شویش با جریانی از فاز متحرک گازی بیاثر انجام میشود. برعکس اکثر انواع دیگر کروماتوگرافی، فاز متحرک با مولکولهای آنالیت برهمکنش ندارد و فقط به عنوان وسیلهای برای گذار مولکولها از داخل ستون عمل میکند. کروماتوگرافی گاز- مایع کاربرد گستردهای در تمام رشتههای علوم دارد و معمولاً با نام مختصر کروماتوگرافی گازی نامیده میشود. این کروماتوگرافی بر پایه تقسیم آنالیت بین یک فاز متحرک گازی و یک فاز تثبیت شده بر سطح یک جامد بیاثر بنا شده است.
۱-۴-۱- اجزای اصلی دستگاه کروماتوگرافی گازی
۱-۴-۱-۱- مخزن گاز حامل
گازهای حامل که باید از نظر شیمیایی بیاثر باشند، عبارتند از هلیم، نیتروژن، و هیدروژن. انتخاب گاز معمولاً با توجه به آشکارساز به کار رفته انجام میشود. به همراه مخزن گاز، شیرهای تنظیم فشار، اندازهنماها وجریانسنجها در دسترس قرار میگیرند.
۱-۴-۱-۲- سیستم تزریق نمونه
کارایی ستون به این نیاز دارد که اندازه نمونه مناسب باشد و به صورت توپی از بخار وارد شود؛ تزریق آهسته مقدار زیاد نمونه سبب پهن شدن نوار و کاهش تفکیک میشود. متداولترین روش تزریق نمونه، استفاده از یک ریزسرنگ برای تزریق نمونههای مایع یا گازی از طریق یک درپوش غشایی خودبند یا دیافراگم لاستیکی سیلیکونی به درون دریچه تبخیرکننده آنی نمونه است که در سر ستون قرار دارد.
۱-۴-۱-۳- ستون وآونستون
در کروماتوگرافی گاز-مایع دو نوع ستون داریم؛ لولهپرشده و لولهباز یا مویین. طول ستونهای کروماتوگرافی از کمتر از ۲ متر تا۵۰ متر یا بیشتر تغییر میکند. ستونها از فولاد زنگنزن، شیشه، سیلیس جوشنخورده یا تفلون ساخته میشوند. برای جا دادن ستونها در داخل آونهای دماپای، معمولاً به شکل حلقههای با قطر ۱۰تا۳۰ سانتیمتر ساخته میشوند.
دمای ستون متغیری مهم است که باید تا چند دهم درجه برای انجام کارهای دقیق کنترل شود و بنابراین ستون معمولاً در یک آون دماپا جا داده میشود. بهترین دما برای ستون به نقطه جوش نمونه و درجه جداسازی مورد نیاز بستگی دارد.تقریباً دمای معادل یا کمی بالاتر از متوسط نقطه جوش نمونه، به یک زمان شویش مناسب منجر میشود. برای نمونههای با گستره وسیع نقطه جوش، برنامهریزی دما به کار گرفته میشود که در آن دمای ستون به طور پیوسته و یا مرحلهای افزایش مییابد، همچنانکه جداسازی انجام میشود.
۱-۴-۱-۴- سامانه آشکارساز
طی توسعه کروماتوگرافی گازی، آشکارسازهای زیادی مورد بررسی قرار گرفته است؛ آشکارسازها نه تنها برای آشکارسازی حضور آنالیتها در انتهای ستون به کار میروند بلکه همچنین اطلاعاتی در رابطه با تعیین هویت آنها در اختیار میگذارند.
آشکارساز یونش شعله[۳۹] (FID)
از متداولترین آشکارسازهای مورد استفاده که عموماً برای کروماتوگرافی گازی اعمالپذیر است. سیال خروجی از ستون با هیدروژن مخلوط و سپس به طور الکتریکی مشتعل میشود. اکثر ترکیبات آلی، موقعی که در دمای شعله هیدروژن/هوا تفکافت شوند، یونها و الکترونهایی تولید میکنند که الکتریسیته را از درون شعله هدایت میکنند. پتانسیلی چند صد ولتی در عرض نوک مشعل و الکترود جمع کننده در بالای شعله اعمال میشود. سپس جریان الکتریکی حاصل برای اندازهگیری به تقویتکننده عملیاتی با آمپدانس بالا هدایت میشود. یونش ترکیبات کربن در شعله، فرایندی است که کاملاً درک نشده است. اگرچه مشاهده شده که تعداد یونهای تولیدی تقریباً متناسب با تعداد اتمهای کربن کاهیده شده در شعله است. از آنجاییکه آشکارساز یونش شعلهای به تعداد اتمهای کربن وارد شده به آشکارساز در واحد زمان جواب میدهد؛ وسیلهای حساس به جرم است تا حساس به غلظت.
آشکارساز یونش شعلهای حساسیت بالا، گستره جواب خطی وسیع و نوفه کم از خود نشان میدهد و عیبش این است که نمونه را تخریب میکند.
۱-۴-۲- کروماتوگرافی گازی/طیفسنج جرمی (GC-MS)
چند سازنده، دستگاه کروماتوگراف گازی عرضه میکنند که مستقیماً میتواند به انواع مختلف طیفسنجهای جرمی با پویش سریع متصل شود. سرعت جریان از ستون مویین عموماً به اندازهای کم است که خروجی از ستون را میتوان به طور مستقیم به محفظه یونش طیفسنج جرمی خوراند. اکثر طیفسنجهای جرمی با قطاع مغناطیسی و چهارقطبی قابلیت اتصال به کروماتوگراف گازی را دارند.
۱-۴-۲-۱- طیفسنج جرمی چهارقطبی[۴۰]
این طیفسنج جرمی معمولاً فشردهتر، ارزانتر ومحکمتر از مشابههای قطاع مغناطیسی خود هستند. از محاسن این دستگاهها آن است که زمانهای رانش پایینی دارند (ms100>) که این امر بهویژه برای پویش بیدرنگ پیکهای کروماتوگرافی مفید است.
قلب دستگاه چهار قطبی، چهار میله استوانهای موازی است که به عنوان الکترود به کار میروند.میلههای مقابل یکدیگر از نظر الکتریکی متصل شدهاند؛ یک زوج به پایانه مثبت منبع dc[41] متغیر و زوج دیگر به پایانه منفی متصل میشود. علاوه براین، پتانسیلهای [۴۲]ac با فرکانس رادیویی که ۱۸۰درجه خارج از فازند، به هر زوج از میلهها اعمال میشوند. برای به دست آوردن یک طیف جرمی با این وسیله، یونها با پتانسیل ۵ تا ۱۰ ولت به درون فضای بین میلهها شتاب داده میشود. در این هنگام، ولتاژهای ac وdc روی میلهها همزمان افزایش مییابند، درحالی که نسبت آنها ثابت باقی میماند. در هر لحظه معین، تمام یونها به آنهایی که مقدار مشخص m/z دارند، به میلهها برخورد میکنند و به مولکولهای خنثی تبدیل میشوند. بنابراین یونها با گستره محدودی از مقادیر m/z به ترانسدیوسر میرسند و به طور کلی دستگاههای چهارقطبی به سهولت یونهایی را تفکیک میکنند که جرم آنها با یک واحد متفاوت است [۳۲].
۱-۴-۳- شاخص بازداری کواتس[۴۳]
شاخص بازداری کواتس (I) اولینبار در سال ۱۹۵۸ توسط کواتس به عنوان یک پارامتر برای شناسایی مواد حلشده با بهره گرفتن از کروماتوگرامها تعریف شد. شاخص بازداری هر ماده حلشده با بهره گرفتن از مخلوطی از اجسام حلشده را میتوان با حداقل دو آلکان نرمال که زمان بازداری آنها در دو طرف زمان بازداری ماده حلشده قرار دارد؛ بهدست آورد. آلکانهای نرمال، استانداردهایی هستند که درجهبندی شاخص بازداری بر پایه آنها بنا شده است. بنا برتعریف شاخص بازداری یک آلکان نرمال برابر ۱۰۰ ضربدر تعداد کربنهای موجود در ترکیب، بدون توجه به مواد پرکننده ستون، دما و سایر شرایط کروماتوگرافی درنظر گرفته شود. شاخص بازداری برای تمام ترکیبات علاوه بر آلکان نرمال، اغلب اوقات با متغیرهای ستون، چند صد واحد شاخص بازداری تغییر میکند.
از مدتها قبل مشخص شده است که در بین یک سری ترکیبات همرده، نمودار لگاریتم زمان بازداری تنظیم شده بر حسب تعداد اتمهای کربن، اگر پایینترین عضو سری حذف شود، خطی است. معمولاً روش نموداری برای تعیین شاخصهای بازداری لازم نیست. در مقابل، دادههای زمان بازداری تعیین شده از درونیابی کروماتوگرام مخلوطی از ماده حلشده مورد نظر و دو یا چند استاندارد آلکان نرمال به دست میآید.
بازگویی این مطلب مهم است که شاخص بازداری برای یک آلکان نرمال مستقل از دما و مواد پرکننده ستون است. ولی شاخص بازداری تمام مواد حلشده دیگر، اغلب از ستونی به ستون دیگر تغییر میکند. سیستم شاخص بازداری، این امتیاز دارد که برپایه مواد مرجعی بنا شده است که به آسانی در دسترس قرار دارند. وگستره نقطه جوش وسیعی را میپوشانند علاوه براین، وابستگی شاخص بازداری آنهابه دما نسبتاً خیلی کم است [۳۲].کواتس رابطه لگاریتمی را برای محاسبه شاخص بازداری پیشنهاد کرد که برای آنالیز GC در دمای ثابت به کار میرود:
محققی دیگر رابطه فوق را برای آنالیز GC با برنامهریزی دمایی به صورت زیر فرموله کرد [۳۲ و ۳۳]:
I : شاخص بازداری برای آنالیز GC در دمای ثابت
IT : شاخص بازداری برای آنالیز GC با برنامهریزی دمایی
: t́Riزمان بازداری تصحیح شده برای پیک نمونه
t́RZ : زمان بازداری تصحیح شده برای n-آلکان خروجی قبل از پیک نمونه
t́R (Z+1): زمان بازداری تصحیح شده برای n-آلکان خروجی بعد از پیک نمونه
:Z تعداد کربن پیک –nآلکان خروجی قبل از پیک نمونه
tTRi: زمان بازداری پیک نمونه
tTRZ: زمان بازداری برای n-آلکان خروجی قبل از پیک نمونه
tTR (Z+1): زمان بازداری برای n-آلکان خروجی بعد از پیک نمونه
۱-۵- ارزیابی سمیت سلولی[۴۴]
سرطان به عنوان یکی از مهم ترین عوامل مرگ و میر درجهان محسوب می شود و همه ساله منجر به مرگ بیش از ۶ میلیون نفر می شود. امروزه مبارزه با سرطان، به خصوص در مورد تومورهایی که رشد سریع دارند با توفیق نسبتاً خوبی همراه بوده است. درمان سرطان به دلیل محدودیتهای بنیادی با مشکلات زیادی مواجه بوده است . به منظور دستیابی به ترکیبات دارای خاصیت ضدسرطان نیاز به یک سری آزمون های غربالگری است. از آنجایی که تحقیقات در زمینه دستیابی به ترکیبات ضد سرطان از منابع گیاهی هر روزه ابعاد گستردهتری پیدا میکند؛ کشف داروهایی مانند آلکالوئیدهای حاصل از گیاه پروانش[۴۵] یا دیترپن تاکسول از پوست درخت سرخدار[۴۶] که در درمان سرطان مورد استفاده قرار می گیرند؛ انگیزه مضاعفی را برای تحقیق در زمینه جستجوی داروهای ضدسرطان با منشأ گیاهی ایجاد کرده است. در این مطالعات آزمون های سمیت سلولی به دلیل سرعت بخشیدن به روال تحقیق و صرف هزینه های کمتر برای جستجوی ترکیبات سیتوتوکسیک استفاده میشود. یکی از معتبرترین این آزمونها، آزمون سمیت میگوی آب شور یا سمیت لارو میگوی آب شور «آرتمیا سالینا[۴۷]» میباشد که مورد تأیید موسسه ملی سرطان درآمریکا (NCI)[48] است. این آزمون با بهره گرفتن از لارو میگویآب شور، برای ارزیابی اولیه سمیت انواعی از عصارههای گیاهی، فلزات سنگین، حشرهکشها، افزودنیهای مواد غذایی و یا ترکیبات دارویی به کار میرود [۳۴].
آرتمیا صدها میلیون سال است که بر روی کره زمین زیست می کند و در حال حاضر در ۵۰۰ دریاچه شور مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان یافت میشود. در شرایط طبیعی این موجودات تولید سیست میکنند. سیستهای آنها دارای یک پوسته و پوشش غشایی در اطراف جنین است. این سیستها بهطور معمول دارای ۶ تا ۱۰ درصد رطوبت و دارای قابلیت بقا تا ۵۰ سال میباشند. سیستها پس از قرار گرفتن در آب دریا برای ۱۵-۲۰ ساعت تولید موجوداتی به نام لارو یا ناپلی[۴۹] میکنند که در حدود ۵/۲ میلیمتر طول داشته و دارای یک جفت چشم میباشند. ۱۲ ساعت پس از تفرج، لارو وارد مرحله دوم میشود. در حدود دو هفته طول میکشدتا ناپلیها بالغ گردند.
اگرچه آزمون آرتمیا سالینا برای تفسیر و توضیح مکانیسمهای سمیت کافی نیست اما یک روش مفید در ارزیابی مقدماتی و تعیین سمیت ترکیبات مختلف آنها است. این روش نیازمند تجهیزات پیچیده و فن آسپتیک نیست. آزمون آرتمیا سالینا قابل اطمینان، سریع، ارزان و اقتصادی است . از این آزمون در تستهای غربالگری و جداسازی ترکیبات سیتوتوکسیک فعال گیاهان و شناسایی بیشتر آنها استفاده میگردد [۳۵ و ۳۶].
عکس مرتبط با اقتصاد