مطالعه و شناسایی سویه¬های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز- قسمت ۱۱ | ... | |
آب مقطر
مستر میکس
Ampliqon
تریپتون
Merck
ایزوپروپانول
Merck
عصاره مخمر
Merck
استات آمونیوم
Merck
اتانول
Merck
ایزوآمیلالکل
Merck
کیت استخراجDNA
دنا زیست
کیت استخراج ژل
یکتا تجهیز آزما
دستگاههای مورد استفاده در این تحقیق به صورت زیر میباشد:
استخراج کوتین در اولین مرحله شناسایی گونه های تولیدکننده آنزیم کوتیناز، نیاز به تهیه سوبسترای کوتین میباشد. با توجه به عدم در دسترس بودن کوتین در بازار لازم بود که آن را از میوه ها تهیه کنیم. به این منظور میوه های سیب قرمز، سیب زرد، گوجه فرنگی و خیارسبز از سوپرمارکت خریداری شدند. میوه ها شستوشو داده و وزن گردیدند آنگاه پوست میوه ها را جدا کرده و بعد از وزن کردن پوست میوه ها، آنها را در بافر اگزالات (۲گرم اگزالیک اسید، ۸گرم آمونیوم اگزالات، ۵۰۰ میلی لیتر آب) به مدت ۴ ساعت جوشانده شد تا پالپها کاملا جدا شوند پوست میوه ها را فیلترکرده و با آب مقطر شستوشو داده و وزن کرده و سپس پوستها را در آون ۴۰ درجه سانتیگراد خشک کرده و آسیاب میکنیم. پودر بدست آمده را در محلول کلرفرم متانول به نسبت۲ به ۱ (۶۰ میلیلیترکلروفرم، ۳۰ میلیلیتر متانول) میریزیم و به مدت ۱۲ تا ۲۴ ساعت روی شیکر قرار میدهیم و سپس به محلول بدستآمده آب اضافه کرده و در دستگاه سانتریفیوژ با دور ۱۲۰۰۰ و به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شدند سه فاز در این حالت تشکیل می شود که فازهای رویی را دور ریخته سپس فاز زیری را جدا میکنیم. فاز زیری را درون پتری ریخته و پتری را در آون ۸۰ درجه سانتیگراد خشک میکنیم. پودر بدست آمده همان کوتین است [۵۶].
نمونه برداری نمونههای قارچی و باکتریایی از پوست میوه و خاک باغچه (مرطوب و از برگهای در حال تجزیه) نمونه معمولی خاک سطح برگ یا میوه های مشکوک به آلودگی تودهی باکتری ، ورمیکمپوست جمعآوری شد.
غربالگری و جداسازی گونه های تولیدکننده آنزیم کوتیناز به منظور غربالگری و جداسازی سریع نمونههای تولید کننده آنزیم کوتیناز از محیط کشتی باید استفاده گردد که کوتین تنها منبع کربن آن برای استفاده میکروارگانیزمها باشد و تنها میکروارگانیزمهایی در این محیط رشد کنند که قادر به تجزیه کوتین باشند.
جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت jemo.ir مراجعه نمایید.
تهیه slant از سویههای جدا شده یک کلنی خاص از سویههای جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنتها به مدت ۴۸ ساعت، آنها در یخچال و دمای ۴ درجه نگهداری میشوند. اسلنتها را هم به مدت ۴۸ ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. ۱۵۰ میلیلیتر آب را و ۳ گرم نوترینت اگار را در بشر با حرارت ملایم حل میکنیم و در هر لوله ۱۵ میلیلیتر میریزیم بعد پنبه میگذاریم و اتوکلاو میکنیم بعد به صورت کج میگذاریم تا ببندد و بعد از بستن و سرد شدن و یک کلنی خاص از سویههای جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنتها به مدت ۴۸ ساعت، آنها در یخچال و دمای ۴ درجه نگهداری میشوند. Slant ها را هم به مدت ۴۸ ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. (slant به مدت یک ماه قابل نگهداری است).
نگهداری طولانی مدت سویهها به منظور نگهداری طولانی مدت سویهها، ابتدا محیط کشت مایع نوترینت براس یا LB تهیه نموده و سویهها را در آن تلقیح کرده و در شیکر انکوباتور به مدت ۲۴ ساعت به منظور رشد بهینه قرار داده می شود سپس ۷۶۰ میکرولیتر از محیط کشت حاوی باکتری و ۷۶۰ میکرولیتراز گلیسرول ۴۰% به میکروتیوبهای ۵/۱ میلی لیتری انتقال داده و به مدت چند دقیقه به آرامی تکان داده می شود و در فریزر۸۰- برای طولانی مدت نگهداری می شود.
تهیه گلیسرول ۲۰۰ میکرولیتر گلیسرول و ۸۰۰ میکرولیتر آب مقطر را بهم افزوده و گلیسرول ۲۰% تهیه می شود.
تهیه محیط کشتLB ۵ گرم y(مخمر)
[چهارشنبه 1400-01-25] [ 02:01:00 ب.ظ ]
لینک ثابت
|