برای تعیین غلظت H2O2، ۰/۲ گرم از بافت برگی با ۳ میلیلیتر تریکلرواستیکاسید (TCA) 1/0 درصد در یک هاون چینی و محیط یخ سائیده شد. سپس عصاره با دور ۳۵۰۰ دور در دقیقه (rpm) به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ گردید. ۱ میلیلیتر از مایع رویی به ۱ میلیلیتر بافر فسفات (۷pH=) و ۲ میلیلیتر یدید پتاسیم یک مولار اضافه و سپس جذب مخلوط در طول موج ۳۹۰ نانومتر قرائت و مقدار H2O2 با بهره گرفتن از ضریب خاموشی ۲۸/۰ میکرومتر در سانتی متر محاسبه و بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر بیان گردید (Velikova et al., 2000).
۳-۴-۹- تعیین میزان آب نسبی برگ (RWC)
برای این آزمایش، از قسمت های انتهایی ساقه چندین برگ کاملاً توسعهیافته جدا و سپس دیسکهایی به قطر ۸ میلیمتر از قسمت میانی پهنک برگ تهیه شد (از هر واحد آزمایشی ۱۰ دیسک برگی)، سپس دیسکها به کمک ترازوی دیجیتالی (با دقت ۰۱/۰ گرم) توزین و به پتریدیش حاوی آب مقطر به مدت ۳ ساعت در یخچال (۴ درجه سانتی گراد) منتقل گردید. پس از خارج کردن دیسکها از آب مقطر جهت حذف رطوبت اضافی سطح دیسکها، آنها را روی کاغذ صافی قرار داده و سپس وزن آماس آنها اندازه گیری شد. پس از تعیین وزن آماس، دیسکهای برگی به آون (۷۰ درجه سانتی گراد) منتقل و پس از گذشت ۴۸ ساعت وزن خشک آنها تعیین و در نهایت RWC با بهره گرفتن از رابطه ذیل محاسبه شد ((Turner,1981.
میزان آب نسبی برگ = [[(وزن خشک – وزن آماس) / وزن خشک –وزن تر) ×۱۰۰
۳-۴-۱۰- تعیین فنول کل گل
برای تعیین فنول کل، ۱ گرم از گلهای کاملا باز شده توزین و با ۶ میلیلیتر اتانول خالص مخلوط و هموژنیزه گردیدند. محلول به دست آمده با دستگاه سانتریفیوژ و با دور g×۱۲۰۰۰ به مدت ۱۲ دقیقه سانتریفیوژگردید. سپس ۵۰ میکرولیتر از محلول شناور جدا نموده و با ۵۵۵ میکرولیتر آب مقطر و ۱۰۰ میکرولیتر (V:V / 1:1) معرف فولینسیکالتو رقیق شد. بعد از سپری شدن ۵ دقیقه در دمای اتاق، ۷۵۰ میکرولیتر از محلول سود نرمال، حاوی ۲۰ گرم در لیتر کربنات سدیم، به هر نمونه اضافه و سپس محلولها به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند. در نهایت میزان جذب نمونهها در طول موج ۷۶۰ نانومتر قرائت گردیدند (Lemomoine et al., 2007).
* تمام ترکیبات (۴ میلی لیتر محلول کربنات سدیم + ۵ میلی لیتر فولین + ۵/۰ میلیلیتر حلال عصاره) به غیر از عصاره، بلانک را تشکیل می دهد (به جای عصاره از ۵/۰ میلی لیتر حلال استفاده شد).
* منحنی استاندارد فنول با غلظت های ۲۵۰ و ۲۰۰ ،۱۵۰ ،۱۰۰ ،۵۰ ،۰ (میلیگرم بر لیتر) از فنول تهیه گردید (شکل ۳-۶). از همبستگی بین غلظت های بکار برده شده فنول (میلیگرم بر لیتر) با جذبهای خوانده شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر برای محاسبه فنول کل عصاره استفاده و بر حسب میلیگرم بر گرم محاسبه گردید.
شکل ۳-۴: منحنی استاندارد فنول کل
۳-۴-۱۱- تعیین مقدار اسانس کل
برای اندازه گیری درصد اسانس از روش تقطیر با آب استفاده می شود. جهت استخراج اسانس از گلهای گیاه استفاده می شود. بنابراین پس از جمعآوری و آماده سازی، گلهای گیاه داخل محفظه مخصوص گیاه در دستگاه کلونجر قرار داده شد. بدین وسیله اسانس همراه با بخار آب در قسمت سرد کننده جمع، اندازه گیری و برحسب درصد بیان می شود.
۳-۴-۱۳- سنجش ترکیبات اسانس
برای شناسایی ترکیبات، اسانس های مورد نظر پس از آماده سازی به دستگاه GC/MSتزریق شدند تا نوع ترکیبهای تشکیلدهنده آنها مشخص شود. دستگاه گاز کروماتوگرافی استفاده شده از نوع Agilent 6890 با ستون به طول ۳۰ متر، قطر داخلی ۲۵/۰ میلیمتر و ضخامت لایه ۲۵/۰میکرومتر از نوع HP-5MS بودet al., 2005) (Young-Cheol.
۳-۵- تجزیه و تحلیل آماری داده ها
برای انجام تجزیه واریانس و مقایسه میانگینهای صفات اندازه گیری شده از نرم افزار SAS نسخه ۱/۹ استفاده شد. مقایسه میانگینها با بهره گرفتن از آزمون چند دامنهای دانکن در سطوح احتمال ۱ و ۵ درصد انجام گرفت. همچنین برای رسم نمودار از نرم افزار Excel استفاده گردید.
فصل چهارم
نتایج و بحث
۴- بررسی تاثیر غلظت ازت و نسبت نیترات به آمونیوم بر پارامترهای مورفولوژیکی گیاه همیشه بهار
۴-۱- تعداد گل در بوته
با توجه به جدول تجزیه واریانس (جدول۴-۱) مشاهده می شود که غلظت ازت بر تعداد گل در بوته در سطح احتمال ۱% معنیدار شد. همچنین نتایج تجزیه واریانس بیانگر تاثیر معنیدار برهمکنش غلظت ازت و نسبت نیترات به آمونیوم در سطح احتمال ۱% بر این صفت بود (جدول۴-۱).
جدول۴-۱: نتایج تجزیه واریانس تأثیر غلظت ازت، نسبت نیترات به آمونیوم و اثرات متقابل بر تعداد گل همیشه بهار
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
تعداد گل |
غلظت ازت |
۱ |
**۲۸/۱۱۶ |
نسبت آمونیوم به نیترات |
۳ |
**۵۳/۴۴ |
غلظت * نسبت |
۳ |
**۶۱/۴۲ |
خطا |
۲۴ |
۱۵/۰ |
ضریب تغییرات |
- |
موضوعات: بدون موضوع
[پنجشنبه 1400-07-29] [ 05:51:00 ق.ظ ]