۵

 

 

بجنورد ۱

 

 

۱۵

 

 

شیروان

 

 

 

۶

 

 

بجنورد ۲

 

 

۱۶

 

 

ماهان کرمان

 

 

 

۷

 

 

تبریز

 

 

۱۷

 

 

ورامین بذر خاردار

 

 

 

۸

 

 

جهرم

 

 

۱۸

 

 

ورامین بذر گرد

 

 

 

۹

 

 

جنت‏آباد قم

 

 

۱۹

 

 

ارومیه

 

 

 

۱۰

 

 

خورآباد قم

 

 

۲۰

 

 

شیراز

 

 

۳-۲استخراج DNA از بافت برگ اسفناج
در این تحقیق استخراج DNA گیاهی بر اساس روش موری و تامسون[۱۳۹] (۱۹۸۰) با اندکی تغییرات به صورت زیر انجام گرفت:
۳-۲-۱مراحل استخراج DNA
۱) ۱۵۰ میلی‏گرم برگ پودر شده را در یک میکروتیوپ ۲ میلی‏لیتری ریخته و ۸۰۰ میکرولیتر بافر [۱۴۰]CTAB (پیوست ۱) از پیش گرم شده در دمای ۶۵ درجه سانتی‏گراد را به آن اضافه گردید،
۲) مخلوط حاصل را به مدت ۲ تا ۳ دقیقه ورتکس نموده تا کاملاً همگن شد،
۳) میکروتیوپ‏های حاوی عصاره همگن شده به مدت ۳۰ دقیقه در بن‏ماری در دمای ۶۵ درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند،
۴) پس از خارج کردن میکروتیوپ‏ها از بن‏ماری، به مدت ۵ دقیقه با دور ۱۲۰۰۰ دور در دقیقه در دمای Cº۴ سانتریفیوژ کرده، سپس مایع رویی (مایع سبز رنگ شفاف) را از فاز جامد زیرین (سبز تیره) با بهره گرفتن از سمپلر جدا و به میکروتیوپ‏های ۵/۱ میلی‏لیتری انتقال داده شد،
۵) زیر هود به هر میکروتیوپ ۲۵۰ میکرولیتر کلروفورم سرد اضافه نموده، سپس به مدت ۵ دقیقه میکروتیوپ‏ها را سر و ته نموده، آنگاه آنها را با دور ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ شدند،
۶) مایع شفاف رویی به دقت با بهره گرفتن از یک تیپ دهانه گشاد به یک میکروتیوپ جدید ۵/۱ میلی‏لیتری منتقل، آنگاه هم حجم آن ایزوپروپانول سرد (۲۰- درجه سانتی‏گراد) افزوده شد. در این مرحله میکروتیوپ‏ها به آرامی به مدت ۲ دقیقه سر و ته گردیدند،
۷) محلول حاوی DNA را به مدت ۵ دقیقه با ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. در این مرحله DNA به صورت یک رسوب سفید رنگ در ته میکروتیوپ مشاهده ‏گردید،
۸) مایع رویی به آرامی دور ریخته و رسوب حاصل سه بار با ۵۰۰ میکرولیتر الکل ۷۰ درصد شستشو و به مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ شد،
۹) پس از شستشوی آخر، الکل باقیمانده در اطراف رسوب DNA با احتیاط با بهره گرفتن از یک تیپ زرد رنگ خارج نموده، سپس رسوب حاصل را به مدت ۴ الی ۵ دقیقه در معرض هوا قرار داده شد تا از حالت سفید رنگ به حالت شیشه‏ای (شفاف) درآید،
۱۰) به هر میکروتیوپ ۵۰ میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه شد،
۱۱) نمونه‏ها را به مدت ۱۵ الی ۲۰ دقیقه در بن‏ماری ۶۵ درجه سانتی‏گراد حرارت داده، آنگاه به مدت ۲ دقیقه با دور ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید،
۱۲) به هر میکروتیوپ ۲ میکرولیتر آنزیم RNAase A افزوده و به مدت ۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. در پایان، نمونه‏ها را به دمای ۴ درجه سانتی‏گراد تا زمان تعیین کمی و کیفی نگهداری شدند.
۳-۳تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده
پس از پایان یافتن استخراج DNA، کمیت و کیفیت آن از دو روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز بر روی ژل آگارز تعیین شد.
۳-۳-۱ روش اسپکتروفتومتری
در این روش از دستگاه نانودراپ استفاده شد. بدین منظور حجم معینی از DNA استخراج شده با آب مقطر رقیق و به حجم معینی رسانده شد، نسبت مذکور فاکتور رقت[۱۴۱] نامیده می‏شود. برای کالیبره نمودن دستگاه حجم خاصی آب مقطر درون کوت ریخته و طیف جذبی آن در طول موج ۲۶۰ نانومتر و ۲۸۰ نانومتر، کالیبره می‏شود. پس از کالیبره شدن دستگاه، حجم خاصی از نمونه DNA رقیق شده درون کوت ریخته شده و A260، A280 و نسبت بین این دو قرائت شد. مقدار عددی جذب در ۲۶۰ نانومتر معیاری از غلظت DNA و نسبت عددی دو مقدار جذب در ۲۶۰ به ۲۸۰ معیاری از کیفیت آن است. یک نمونه DNA خوب دارای نسبتی معادل ۲-۸/۱ می‏باشد. اگر نسبت به دست آمده از ۸/۱ کمتر باشد نشان دهنده‏ی وجود پروتئین، فنل و دیگر مواد ناخالصی است که می‏توانند تابش فرابنفش را جذب کنند. اما چنانچه نسبت بدست آمده بیشتر از ۲ باشد نشان دهنده‏ی وجود RNA و DNA تک رشته‏ای در DNA استخراج شده است. نسبت عددی حاصل برای نمونه‏های DNA استخراجی در این تحقیق بین ۸/۱ تا ۲ متغیر بود که نشان دهنده‏ی کیفیت مطلوب آنها بود.
برای تعیین غلظت DNA از فرمول زیر استفاده می‏شود:
A260 *DF*50 = غلظت DNA بر حسب نانوگرم در میکرولیتر
Df ضریب رقت است و با توجه به میزان دفعاتی که محلول پایه رقیق شده است تعیین می‏گردد.
۳-۳-۲روش الکتروفورز در ژل آگارز
روش دیگر تعیین کیفیت، استفاده از ژل آگارز ۲/۱-۸/۰ درصد می‏باشد که در آن باندها از لحاظ قطر و درخشندگی کنترل می‏شوند. در این روش ۲ میکرولیتر از نمونه های DNA همراه با ۱ میکرولیتر بافر بارگذاری[۱۴۲](پیوست ۲) و ۷ میکرولیتر آب در چاهکهای ژل آگارز بارگذاری شده همچنین در یکی از چاهک‏ها نیز مقدار ۱ماکرولیتر از نشانگر bp100شرکت فرمنتاز[۱۴۳] لود می‏شود و به مدت ۵۰ دقیقه تحت ولتاژ ۹۰ الکتروفورز شد. پس از تفکیک، با بهره گرفتن از دستگاه ژل داکیومنتیشن (شرکت Biometra) و اشعه‏ی ماورای بنفش با طول موج ۲۶۰ نانومتر عکس ژل‏ها تهیه گردید.
به این ترتیب، تراکم باندهای DNAحاصل از استخراج نمونه‏های گیاهی با تراکم باندهای نشانگر bp100 مقایسه و اندازه آن تخمین زده شد. کمیت DNA استخراج شده با مقایسه چشمی ضخامت باندهای DNA ژنومی با باند اول نشانگر bp100 تعیین گردید. پس از تعیین غلظت‏ها، غلظت مورد نیاز با بهره گرفتن از رابطه C1V1=C2V2 تا غلظت ۲۵ نانوگرم در ماکرولیتر برای انجام PCR رقیق گردید.
۳-۴ آغازگرهای مورد بررسی
در این تحقیق از ۱۰ جفت آغازگر اختصاصی اسفناج که بر پایه مطالعات قبلی دارای چندشکلی مناسب در اسفناج بودند، از مجموعه نشانگرهای ریزماهواره‏ای اسفناج که توسط گروبن و همکاران (۱۹۹۸) از ناحیه فلنکینگ ریزماهواره‏های اسفناج طراحی شده بود استفاده گردید (جدول ۳-۲). آغازگرها بر مبنای محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC)، توزیع یکسان آن‏ها بر روی کروموزوم‏ها و پیوستگی با مکان‏های ژنی کنترل کننده برخی از صفات کمی انتخاب و ساخت آن‏ها به شرکت تکاپو زیست سفارش داده شد. جهت ساخت محلول‏های پایه آغازگرها و محلول‏های کاری بر اساس توصیه شرکت سازنده عمل و محلول‏های پایه با غلظت ۱۰۰۰ پیکومول[۱۴۴] در میکرولیتر و محلول‏های کاری با غلظت ۱۰ میکرومولار تهیه گردید.
۳-۵بهینه‏سازی واکنش PCR برای آغازگرهای SSR
جهت انتخاب آغازگرهای مناسب، تعیین دمای اتصال آن‏ها و بهینه‏سازی شرایط PCR از مخلوط DNA‏ی کل ۲۰ توده به نسبت مساوی استفاده گردید. دمای اتصال بر اساس نسبت توالی‏های بازهای نوکلئوتیدی (C+G)، اطلاعات طراحی آغازگرها و نتایج انجام واکنش‏های آزمایش گرادیانت[۱۴۵] برای یافتن دمای بهینه تعیین شد. بدین منظور ابتدا دمای اتصال مناسب آغازگرها با انجام واکنش در چهار دمای متفاوت براساس دمای توصیه شده توسط شرکت سازنده و مطابق با برنامه گرادیانت PCR تعیین و دمای اتصال مناسب انتخاب گردید.
جدول ۳-۲ مشخصات آغازگرهای مورد استفاده در تحقیق (گروبن، ۱۹۹۸)

 

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.