روش های دیگر برای سنتزهای نانو ذرات طلا شامل کاهش فیزیکی (Sun 2003 ) ، کاهش فتوشیمیایی (Kundu 2007) (نانو ذرات طلا مکعبی) ، کاهش زیست شناسی(Mitra and Das 2008) ،(هیدروژل های مولکولی آمفیفیلیت های پپتیدی برای تولید اشکال مختلف نانو ذره) ، و تکنیک های تبخیر حلال است (Pyrapssopolus 2007) . اخیرا” ، یک روش پرتوافشانی میکرو ویو موثرپرهزینه برای سنتز این نانو ذرات کنترل شده با شکل گزارش شد. دراین روش، پرتوافشانی نمک Au در واسطه میسلی CTAB، با وجود آلکالین ۲، ۷- نفتالین دی هیدروکسی (۲,۷ DHN ) ، نانو ذرات طلا مثلثی ، میله ای ، چندضلعی و کروی منحصربفردی در ظرف ۹۰ ثانیه ایجاد می کنند.

نانو ذره طلا بیمتالیک مثل Au- Ag نیز بخاطره کاتالیست جالب ، خواص الکترونیکی و ساختاری و حساسیت خواص پلاسمون سطح شان (SPR) مورد توجه قرار گرفته اند (Huang 2004, Lee and El-Sayed 2006 ) . بنابراین، پیشرفت روش های ساده و قابل فهم برای سنتز نانوذرات بیمتالیک در حال حاضر خیلی سودمند است. نانوذرات آلیاژ Au- Ag کروی که نوار SPR آنها به آسانی با کسرهای مولی طلا تنظیم می شودمی تواند با کاهش نمک Auو Ag با سیترات سدیم در محلول آبی بازتابنده بدست آید. (Sun and Xia 2003) . یک روش تعدیل شده با بذر (Lu 2002, Sun and Xia 2003 ) برای ساختن میله های نانویی با پوسته و هسته Auو Ag از یون های نقره بااستفاده از میله های نانویی طلا بعنوان بذرها نیز گزارش شده است. روش های دیگر برای سنتز نانو ذره طلا بیمتالیک شامل تکنیک رسوب پت پتی (Sputter) در مایعات یونی (Okazaki 2008 ) ، سنتز فتوشیمیایی (Pal and Esumi 2007) ، و رسوب Auو Ag در سیلیس می باشد (Pal and De 2007) .اخیرا” یک روش میکرومولسیون معکوس برای تدارک نانوذرات Auو Ag با روکش سیلیسی ایجاد شده است (Han 2008) سالهاست سهولت ساخت و خواص نوری و شیمیایی منحصر بفرد در کاربرد نانو ذره طلا در تصویربرداری مولکولی مختلف و کاربردهای تحویل مورد توجه قرار گرفته اند.جالب تر اینکه توزیع زیستی منحصربفرد آنها در تومورها منجر به کشف نانو سیستم های طلا بعنوان وسیله ای برای عوامل شیمی درمانی شده است.
در تصویربرداری زیستی (Bioimaging) محققین ازعوامل برون زای مختلف برای مجسم کردن قسمت های زیرسلولی اصلی استفاده کرده اند. تصویربرداری سلولی از طریق تولید کنتراست کلریمتری بین ارگانل های زیرسلولی و سلولی مختلف بااین عوامل تصویربرداری بدست آمد. عوامل تصویربرداری برون زایی معمولی شامل شلات های لانتانید و فلوروسفرهای آلی است (Sharma 2006 ) . بااینهمه ، فلوروسفرهای آلی مستعد به سفیدسازی نوری ، زمینه های کوآنتوم پایین و دریچه انتشار وسیع می باشند( Bruchez 1998, Chan 2002 ) . به عبارت دیگر شلات های لانتانید مستعد موقعیت یابی غیرانتخابی در فضای خارج وریدی می باشند (Sharma 2006 ) . عیب و نقص های عوامل تصویربرداری معمولی کاربردهایشان را بعنوان ابزارهای تشخیصی بیومدیکال محدود کرده اند و به نانوذرات معمولی مثل نانوذرات مغناطیسی (Kim 2003, Martina 2005, Lee 2006 ) Q- dot ها و نانو ذره بعنوان عوامل کنتراست دیگر تحریک کرده اند. این نانو مواد ابزارهای تشخیصی بهینه ای هستند زیرا آنها بیشتر حساسیت های عوامل تصویربرداری معمولی را حذف می کنند. بااینهمه ، سیتوتوکسیتی شدید بیشتر نانو مواد فایده شان را در کاربردهای آزمایشگاهی و در محیط زنده از دست داده اند. El-Sayed 2005) Thurn 2007, Lewinski 2008,). نانو ذرات طلا استثناهای منحصربفردی هستند زیرا آنها نسبت به محیط سلولی قابل تحمل تر و هماهنگ ترند Tkachenko 2003, Connor 2005, Shukla 2005 ) بنابراین کنتراست کلریمتری مشاهده شده در سلوب های درمان شده با نانو ذرات طلا می تواند با اندازه، شکل یا حتی تغییر سطح آنها بخاطره یک پدیده بنام رزنانس پلاسمون سطح SPR کنترل شود. وقتی برانگیخته شد ، رزنانس پلاسمون سطح ( ( SPR نانو طلا می تواند نور را در طیف قابل رویت یا نزدیک مادون قرمز، یک خاصیت فوق العاده مفید برای تکنیک های تصویربرداری نوری در محیط زنده ،و تصویربرداری لومینسنس دو فتونی پخش و جذب کند این دو تکنیک تشخیصی نوری مخصوصا کنتراست سلولی با تنظیم رزنانس پلاسمون سطح ( ( SPR نانو ذره طلا تا طیف NIR تولید می کند. دیگر ابزار تشخیصی غیرتهاجمی مثل MRI و توموگرافی محاسبه شده اشعه ایکس از ذره بعنوان عامل کنتراست دهنده بترتیب برای سهولت تغییرسطح و ضریب جذب اشعه ایکس بالاتراستفاده کرده است.
MRI یک ابزار تشخیصی غیرتهاجمی است که از میدان های مغناطیسی تا ترکیب ناهمگون آب در ارگانیسم ها استفاده می کند Weissleder and Mahmood 2001, Caravan 2003)). مقادیر مختلف رلاکسیویته پروتون آب به تصاویر کنتراست دهنده سلول های مختلف تبدیل می شود. تصاویر MRI را می توان با کاهش زمان رلاکسیون عرضی و طولی پروتون آب افزایش داد (Caravan 1999,Merbach and Toth 2001) . این افزایش اغلب با بهره گرفتن از عامل کنتراست دهنده مثل شلات های گادولینوم یا اکسید آهن سوپرپارامغناطیسی مشاهده می شود (Aime 1998 ). سرطان درمانی فتودینامیک بر اساس خواص سلول های سرطانی با اکسیژن یکتایی^[۴۰] تولید شده با لیزر که سیتوتوکسی است می باشد. یک مقدار بیشتر از یک رنگ خاص که برای تولید اکسیژن یکتایی است در سلول های سرطانی اتخاذ می شود وقتی با یک بافت سالم مقایسه می شود، بنابراین یک اشعه لیزری تابیده شده به سلول تنها سلول های سرطانی را از بین می برد. متاسفانه یک تاثیر جانبی از این درمان وجود دارد، مولکول های رنگی باقیمانده به سمت پوست و چشمها حرکت می کند و بیمار به نور خورشید خیلی حساس می شود، این تاثیر برای شش هفته ادامه می یابد. تلاش برای جلوگیری از بروز این اثر به صورت محصور شد مولکول های رنگ در داخل یک نانو ذره متخلخل منجر شد، در نتیجه رنگ در نانو ذرات باقی می ماند و به بخش های دیگر بدن پخش نمی شود، حتی اگر رنگ در نانو ذرات باقی نماند توانایی برای تولید اکسیژن بخاطر اندازه حفره(حدود ۱ نانومتر) که می تواند آزادانه اکسیژن را به بیرون پخش کند، باقی نمی ماند و موثر واقع نمی شود.
۲-۳-۱توموگرافی محاسبه شده اشعه ایکس :
توموگرافی محاسبه شده اشعه ایکس (X-ray CT )روش تشخیصی غیرتهاجمی دیگریست که تصاویر سه بعدی از سلول های مختلف براساس یک سری از تصاویر اشعه ایکس دو بعدی پیرامون یک محور چرخشی تکی ایجاد می کند. عوامل کنتراست دهنده اغلب برای افزایش کنتراست بین سلول ها بعلت میل ترکیبی آنها برای جذب اشعه ایکس بکار می رود. یکی از پرکاربردترین عوامل کنتراست دهنده توموگرافی محاسبه شده اشعه ایکس اولتراویست (Ultravist ) (iopromide) یک رنگ مولکولی کوچک یدی نام دارد.
شکل۲-۱ : ساختار شیمیایی اولتراویست (Ultravist ) (iopromide) ، یک عامل کنتراست بکاررفته در توموگرافی محاسبه شده اشعه ایکس
چندین نقص اولتراویست وجود دارد که شامل مسمومیت کلیوی، نشت وریدی و فاصله تصویربرداری محدود بخاطره دفع کلیوی سریع است (Kim 2007). محدودیت مشاهده شده در عوامل کنتراست دهنده CT اخیرا” با بهره گرفتن از نانو ذره مغلوب شد. نانو ذرات طلا چندین امتیاز بر عوامل کنتراست دهنده فعلی دارد مثل ضرایب بالاتر جذب اشعه ایکس ، تنوع کاربرد در تغییر سطح و کنترل منظم اندازه و شکلنانو ذرات طلا . اخیرا” کیم و همکارانش بررسه های CT را بر روی این نانو طلا با روکش پلی اتیلن گلیکول (PEG) بعنوان عامل آنتی بیوفولینگ تا آزمایش کاربردهای محیط زنده بعنوان عوامل کنتراست CT برای آنژیوگرافی و شناسایی هپاتوم انجام دادند. اندازه گیری های ضریب جذب اشعه ایکس در آزمایشگاه نشان می دهد که کاهش نانو ذرات طلا با روکش پلی اتیلن گلیکول (PEG) 5.7 بار بالاتر از اولتراویست (Ultravist ) در چنین غلظتی است. با روکش پلی اتیلن گلیکول (PEG) یک گردش خون بلندمدت تری(تقریبا” ۴ ساعت بدون اتلاف ظاهری در مدل موش ها) نسبت به اولتراویست (Ultravist ) با تنها حدود ۱۰ دقیقه دارد. این نتایج سهولت نانو ذره را بعنوان یک عامل کنتراست CT در محیط زنده نشان داد. هرچند هیچ مسمومیت قابل توجهی در سلول های کبدی در معرض نانو ذره با روکش پلی اتیلن گلیکول (PEG) برای ۲۴ ساعت شناسایی نشد، بررسی های بیشترباید برای نانو ذرات طلا با روکش پلی اتیلن گلیکول (PEG) قبول شد تا یک عامل کنتراست مفید از لحاظ کلینیکی بررسی شود.
۲-۳-۲ حسی زیستی ( Biosessing) :
بیو سنسورها از مولکول های زیست شناسی مثل آنتی بادی ها، آنزیم ها، کربوهیدرات ها و اسیدهای نوکلئیک برای شناسایی یا پیگیری دوره هر پدیده بیولوژیکی جالب استفاده می کند (Otsuka 2001 Mc Fadden 2002 ). واکنش ها مثل پیوند هیدروژنی و انتقالات مرحله به مرحله بین مولکول های گیرنده و لیگاند همراه با تکنیک های قابل برداشت مثل کلریمتری، فلورسانس ، پیام های بیومغناطیسی برای حس رویدادهای بیوشیمیایی خاص بکارمی روند( ( Mc Fadden 2002
بیوسنسور ها کاربردهای مختلفی دارند: پردازش غذا ، برای کنترل پاتوژن های موجود در غذا در عرضه غذا، کنترل محیطی برای شناسایی آلودگی ها و سموم در محیط، دفاع رفاه زیستی برای شناسایی باکتری ها ، ریروس ها و سموم زسیت شناسی و تشخیص های کلینیکی برای اندازه گیری سطوح گلوکز خون (Mc Fadden 2002 )
نانو ذرات طلا خواص الکترونیکی و نوری خاص مثل SPR افزایش شده ، انتشار افزایش یافته سطح و پخش رامان افزایش یافته سطح (SERS) را نشان می دهداین نانو ذرات بطور کارآمدی لومینسنس دو فوتونی را منتشر می کند زیرا آنها می توانند SPR رابا حداقل رطوبت بعد از تحریک فوتون نگه دارند . این خواص در حس یا کنترل رویدادهای مولکولی متعددی از جمله واکنش پروتئین با پروتئین، انباشتگی پروتئین و پیچیدن پروتئین بکاررفته اند (De 2007 ). برای مثال پیام های AuNPs SPR نه تنها برای شناسایی DNA ها بکاررفته اند بلکه برای تمایز میان زوج های DNA ناجورو خوب نیز بکار رفته اند. میرکین و همکارانش گزارش کردند.
نانو ذرات طلا که باآن یک مخمر iso-1-cytochorome c (Cytc) بصورت کووالانسی می چسبد ، زار و همکارانش نشان داده اند که نانو ذرات طلا را می توان بعنوان یک سنسور برای پیگیری جفت شدن یک مولکول پروتئینی بکار برد. به استناد قرار گرفتن در یک بافر با pH متفاوت ، Cytc افزودنی در pHپایین جفت نمی شوندبنابراین توده نانو ذره در حالی القا می شود که در pH بالا اتفاق بیفتد.تا منجر به ایجاد توده می شود. این تغییرات تطبیقی موجب تغییرات قابل سنجشی در رنگ نانو طلا می شود و می تواند با اسپکتروسکوپی جذب US-VIS شناسایی شود (Chah 2005). دریک چنین حالتی ، تغییرات وابسته به pHدر رزنانس پلاسمون اخیرا برای ردیابی تغییرات ساختاری پروتئین القا شده. درمان فتوترمال یک روش تجربی تقریبا تهاجمی است که برای درمان سرطان و حالات مربوطه امیدوارکننده است. این ترکیبی از ۲ عنصر اصلی است : (۱) منبع نور ، (۲) لیزرهای خاص با یک دامنه طیفی ۶۵۰-۹۰۰nm برای نفوذ عمیق به بافت و(۲) جذب نوری نانو طلا که پرتوافشانی نوری را در یک مقیاس زمانی پیکوپانیه به گرما تبدیل میکند و بدینوسیله موجب آبلاسیون فتوترمال می شود. (Chen 2007). پیشرفت های اخیر نشان داده است که نشان طیفی آنها را می توان ساخت یا با تنظیم شکل واندازه تنظیم کرد. . ال-ساید و همکارانش نشان دادند که میله های نانویی طلایی یک باند جذب طولی در NIR به علت نوسانات SPR دارند و بعنوان عوامل فتوترمی موثرند. نانوساختارهای طلایی دیگر مثل نانوپوسته های طلایی، قفس های نانوی طلایی و نانوکروی های طلایی نیز خرابی فتوترمی موثری از سلول ها و بافت سرطانی نشان داده اند. بااینهمه ، هدف محیط زنده موثر نانو ذرات طلا برای جمعیت نامتجانس سلول ها و بافت سرطانی هنوز به انتخاب بهتر و عدم مسمومیت به سلول های نرمال پیرامون نیاز دارد. هرچند درمان های مبنی بر نانو ذرات تاثیر خوبی برای ارائه در تومورها نشان داشته اند ، هیچ یک از تومورها تابع این تاثیر مخصوصا باتوجه به ارائه نانوذرات نسبتا بزرگ نیستند. علاوه براین،فوتوترمولیسیز برای تومورهای کوچک یا سلول های متاستاتیک تکی بکار نمی رود زیرا انتشار گرما از ذرات داغ محیط بافت آسیب دیده را در مدت زمان طولانی تر افزایش میدهد. بنابراین ، روش های دیگر ارائه نانوذرات انتخابی باید به منظور دست یابی به درمان فتوترمال موثر ایجاد شود. بررسی های اخیر نشان داده است که AuNPs متصل به آنتی بادیها و بردارهای ویروسی را می توان برای درمان فوتوترمی موثر و انتخابی بکار برد. هوآنگ و همکارانش(۲۰۰۶) نشان دادند که میله های نانو طلایی متصل به آنتی بادی های گیرنده عامل رشد آنتی بادی (anti-EGFR) بطور انتخابی خطوط سلولی را هدف قرار دهند که EGFR را بیان می کند.ارائه لیزر مداوم بعدی سلول های درمان شده با نانوذرات منجر به خرابی فتوترمی سلول های مثبت EGFR در نیمی از انرژی مورد نیاز برای کشتن سلول های منفی EGFR شد. بنابراین درمان خط سلول سرطان سینه HER2 نانو پوسته های طلایی با هدف HER2 و نانوقفس ها بعد از ارائه نور لیرزبرای القای انتخابی مرگ سلولی به سلول مثبت HER2 در آزمایشگاه نشان داده شده است. ترکیبات مواد مغناطیسی اثرات جانبی بدی بسته به دوز نشان داده اند. از این گذشته ، شباهت اندازه نانو ساختار های طلا به مواد بیولوژیکی میتواند به موانع سلولی کاموفلاژ^[۴۱] دهد و منجر به ورود سلولی نامطلوب شود که ممکن است برلی عملکرد سلولی نرمال مضرباشد. امید اینکه ورود سلولی نانو ذره طلا غیرعمدی می تواند منجر به اثرات جانبی سمی شود تلاش های زیادی را برای ارائه بینش بهتر به پروفیل مسمومیت می طلبد. اخیرا پن و همکارانش یک بررسی سیستمیک از سیتوتوکسیتی محلول آب بسته به اندازه نانو ساختار های طلا تثبیت شده با تریفنیل فسفونین برعلیه چهار سلول زیر انجام داده اند: سلول های اپیتلیال کارسینوم سرویکس هلا ،سلول های ملانوم Sk-Mel-28،
تحویل موثر نانو ذرات طلا در یک سیستم زنده به موانع بیولوژیکی طبیعی غالب مثل غشایی سلولی نیاز دارد. برای هدف گیری تومور خاص ،نانو ذرات طلا با چالش های دیگری از موانع بین توموری و تشخیص گیرنده مواجه است. روش بالقوه برای بهینه سازی تحویل نانو ذره کاهش اندازه ذره یا کسب تعدیل سطح است.
جایگاه اتصال آنزیم: بیشتر پپتید های بکاررفته برای تحویل نانو ذرات طلا هسته های سلول را هدف قرار می دهند. هسته یک هدف جذاب برای درمان فوتوترمی است زیرا حاوی دستگاه های ژنتیک سلولی است. این پپتیدهای نافذ به غشای هسته ورود نانو طلا را به هسته با اولین اجازه ورود در سلول از طریق RME بعد از مکان یابی هسته از طریق واکنش با کمپلکس روزنه هسته آسان می کند . بیشتر پپتیدهای نافذ به غشای هسته مشتق از منابع ویروسی هستند. . نمونه های معمول شامل پپتیدهای مکان یابی هسته ویروس Simian ، HIV1 ، پپتیدهای مشتق از پروتئین تات و پپتیدهای مشتق از پروتئین فیبر آدنوویروس. دیگر پپتیدهای با هدف هسته که بعنوان یک وسیله نقلیه برای نانو ذره عمل می کند شامل اشکال مختلف پپتید های RGD می باشد.
در شکل زیر نحوه اتصال به نانو ذرات طلا نشان داده شده است.
۲-۴ مطالعه سمیت نانو ذرات مغناطیسی:
برای اطمینان از بی خطر بودن یک سیستم نانو ذره مغناطیسی توسعه یافته برای استفاده، سمیت اجزا نانوذره به طور کلی باید تخمین زده شود. برای تخمین سمیت نانوذرات در نظر گرفتن دو چیز ضروری است. اول چگونگی برهمکنش نانوذرت موجود در بدن در طول مدت فعالیت و دوم بررسی چگونگی تاثیر ذرات مستقل در حین تخریب و یا پردازش های کبدی که به آن اعمال می شود.سمیت شناسی نانوساختارها برای بخشی از مطالعات ظاهر شده اند اما مطالعات بیشتری برای اطلاع از جزئیات پاسخ بدن به اجزای نانویی نیاز می باشد.
شکل ۲-۲: میزان مقاله های منتشر شده در مباحث سمیت نانوساختارها
نانو ذرات مغناطیسی در مقایسه با سایر نانوذرات بر پایه فلزات سنگین سمیت کمتری دارند و حتی در بعضی موارد غیر سمی در نظر گرفته می شوند در یک نمونه مطالعاتی دیده شد نانو ذرات که دارای جزئی از آهن فیزیولوژیک بدن می باشد، آهن اکسید موجود در آنها بوسیله پروتئین های فریتین،ترانسفرین و هموسیدرین متابولیزه و ذخیره می شود.
فصل سوم
روش شناسایی تحقیق(متدولوژی)
۳-۱ واکنشگرها :
واکنشگرها و مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش همگی با خلوص بالا و از شرکتهای معتبر تهیه شده اند.
هیدروژن تترا کلرو اورات (HAuCl₄) از شرکت مرک (Merck) با کد شناسایی ۱۰۱۵۸۲ تهیه شده است.
سیستامین (Cysteamine) از شرکت فولیکا (Fluke) با کد شناسایی ۳۰۰۷۰ تهیه شده است.
تری سدیم سیترات (C₆H₅Na₃.5H₂O) از شرکت مرک (Merck) با کد شناسایی ۱۰۶۴۴۸ تهیه شده است.
تترا متیل آزنیوم هیدروکسید (TMOH) از شرکت مرک (Merck) با کد شناسایی ۱۰۸۱۲۴ تهیه شده است.
کلرید آهن۲ (FeCl₂.4H₂O) از شرکت سیگماآلدریچ (Sigma Aldrich) با کد شناسایی ۳۸۰۰۲۴ تهیه شده است.
کلرید آهن۳ (FeCl₃.6H₂O) از شرکت سیگماآلدریچ (Sigma Aldrich) با کد شناسایی۳۱۲۳۲ تهیه شده است.
۳-۲ تهیه محلول ها:
محلول اولیه طلا با غلظت ۰٫۱ درصد وزنی _ حجمی از حل کردن ۰٫۱ گرم از
هیدروژن تترا کلرو اورات در بالن حجمی ۱۰۰ میلی لیتر و به حجم رساندن با آب فاقد یون تهیه شده است.
محلول اولیه تری سدیم سیترات با غلظت ۰٫۱ مولار از حل کردن ۰٫۳ گرم از تری سدیم سیترات در بالن حجمی ۱۰ میلی لیتر و به حجم رساندن با آب فاقد یون تهیه شده است.
محلول اولیه تترا متیل آزنیوم هیدروکسید با غلظت ۵ میلی مولار از حل کردن ۰٫۰۲ سی سی از (TMOH) در بالن حجمی۵۰ میلی لیتر و به حجم رساندن با آب فاقد یون تهیه شده است.
محلول اولیه سیستامین با غلظت های ۰٫۵، ۰٫۱ و ۰٫۰۵ از حل کردن به ترتیب ۰٫۹ و ۰٫۱ و ۰٫۰۹ گرم از سیستامین در بالن حجمی ۲۵ میلی لیتر و به حجم رساندن با آب فاقد یون تهیه شده است.
۳-۳ دستگاه ها :
طیف های جذبی با بهره گرفتن از دستگاه طیف سنجی UV-Vis ساخت شرکت Jasco ژاپن مدل v-530 با سل کوارتزی ۱ سانتی متر ثبت شد طیف ها در محدوده ۲۰۰ تا ۸۰۰ ثبت شد.
دستگاه Inkubator1000 برای در مجاورت قرار گرفتن سیستامین با نانو ذره آهن پوشیده شده با طلا و هم خوردن آنها با هم مورد استفاده قرار گرفت.
همچنین برای سونیکیت شدن نانو ذره آهن از دستگاه اولتراسونیک ساخت شرکتBandelin مدل RK156.
دستگاه شیکر ساخت شرکت Hridolph آلمان مدل unimax 1010DT استفاده شد.
اسپکترو فتومتر FT-IR ساخت شرکت Jasco ژاپن مدل FT-IR410 استفاده شد.
ترازو با دقت۰٫۰۰۰۱ گرم ساخت شرکت Limited ژاپن استفاده شد.
میکر.سکوپ الکترونی TEM ساخت شرکت Philips هلند مدل CM30 مورد استفاده قرار گرفت.
آون ، ساخت شرکت Shimaz ، مدل Shimaz
هیتر مگنت، ساخت شرکت Alfa ، آلمان ، فرانکفورت مدل HS 860
حمام اولتراسونیک ، ساخت شرکت Bandelin، آلمان، بندلین، مدل RK 156