۱-۵-۱-۲ سیلندر پلیت
در اینجا سیلندرهایی از جنس چینی یا فولاد ضد زنگ به عنوان مخزن ماده ضد میکروبی مورد استفاده قرار می­گیرند. پس از گرمخانه­گذاری، سیلندرها برداشته شده و میانگین قطر هاله­های رشد اندازه ­گیری می­شوند.
۱-۵-۱-۳ دیسک
این روش، مبتنی بر قرار دادن دیسک­های کاغذی حاوی ماده ضد میکروب بر سطح محیط کشت تازه تلقیح شده است.
۱-۵-۲ روش­های رقیق­سازی[۴]
در این روش از رقیق­کردن عامل ضد میکروبی به نسبت­های معیّن استفاده می­ شود و خود به دو روش تقسیم می­گردد:
۱-۵-۲-۱ روش رقت آگار
در این روش نمونه مورد بررسی در حلال مناسب حل می­شوند و یا به صورت سوسپانسیون در می ­آید سپس با محیط کشت آگاردار مخلوط می­ شود. نتایج به دست آمده از این روش عموما با نتایج حاصل از روش­های نفوذی و سایر روش­های رقیق­سازی مطابقت دارد. این روش سریع است و با بهره گرفتن از آن می­توان مقدار MIC[5] یک ترکیب را در برابر چند میکروارگانیسم به صورت هم­زمان تعیین کرد.
۱-۵-۲-۲ روش لوله یا رقت مایع
این روش بسیار دقیق است. در این روش رقت­های مختلف از عوامل ضد میکروبی را به همراه محیط کشت مایع و غلظت یکسانی از کشت باکتریایی را در لوله­های متوالی ریخته و پس از سپری شدن زمان لازم، رشد یا عدم رشد میکروارگانیسم­های مورد آزمایش را با توجه به غلظت عامل ضد میکروبی ارزیابی کرده و پایین­ترین غلظتی را که توانسته است از رشد میکروبی جلوگیری کند به عنوان MIC عامل ضد میکروبی در نظر می­گیرند. در این روش به­ دلیل تماس مستقیم ترکیب با میکروارگانیسم­ها، حتی اگر عصاره مورد بررسی انحلال­پذیری کمی در آب داشته باشد، اثر ضد میکروبی آن مشخص می­ شود.
۱-۶ بررسی میکروارگانیسم­های مورد استفاده
۱-۶-۱ تاریخچه میکروب­شناسی
کاشف دنیای میکروبی تاجری هلندی به­نام آنتونی وان لیون هوک[۶] (۱۷۲۳-۱۶۳۲) بود. مهم­ترین فعالیت اصلی لیون هوک همانا کشف دنیای میکروبی است که آن را معاصرینش انیمال کول[۷] یا حیوانک نامیدند. کلیه انواع میکروارگانیسم­های تک­یاخته­ای که امروز می­شناسیم از قبیل پروتوزوآ، آلگ­ها، قارچ­ها و باکتری­ ها اولین بار توسط لیون هوک تشریح شده است [۵۵].
۱-۶-۲ مورفولوژی باکتری­ ها

باکتری­ های کروی[۸] یا گرد[۹]

باکتری­ های باسیلی شکل[۱۰]، استوانه­ای[۱۱] یا میله­ای شکل[۱۲]

باکتری­ های مارپیچی[۱۳] و میله­ای خمیده [۵۶].

۱-۶-۳ استافیلوکک­ها
استافیلوکک­ها باکتری­ های کروی شکل گرم مثبتی هستند که معمولا به صورت اجتماعات نامنظم و به شکل خوشه انگور دور هم قرار می­گیرند. این باکتری­ ها از نظر متابولیکی فعال می­باشند و قابلیت رشد بر روی محیط­های کشت مختلفی را دارند. این باکتری­ ها کربوهیدرات را تخمیر می­ کنند و رنگدانه­ هایی تولید می­ کنند که از سفید تا قهوه­ای پررنگ متغیر می­باشند. بعضی از این استافیلوکک­ها متعلق به فلور طبیعی پوست و غشاهای مخاطی انسان می­باشند و بعضی دیگر از این استافیلوکک­ها باعث ایجاد چرک، آبسه و انواعی از عفونت­های چرکی و حتی گند خونی­های[۱۴] شدید کشنده می­شوند. استافیلوکک­ها به سرعت به تعداد زیادی از عوامل ضد میکروبی مقاوم می­شوند و در حال حاضر مشکلات درمانی صعب العلاجی را ایجاد کرده ­اند [۵۷].
۱-۶-۳-۱ استافیلوکوکوس اورئوس[۱۵]
باکتری استافیلوکوکوس اورئوس از عوامل اصلی ایجاد عفونت­های بیمارستانی بوده که شیوع آن رو به گسترش است. این باکتری در ایجاد طیف وسیعی از بیماری­ها از جمله اندوکاردیت، استئومیلیت، پنومونی، سندروم شوک توکسیک، کورک یا دمل و غیره نقش دارد. بررسی­ها نشان داده است که بالغ بر ۲۵ تا ۳۰ درصد افراد در جوامع مختلف، ناقل باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در بینی خود می­باشند که در بسیاری از موارد می­توانند به­عنوان منشا عفونت­های بعدی عمل نمایند [۵۸].
گسترش روزافزون سویه­های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به آنتی­بیوتیک­ها نظیر وانکومایسین، یکی از معضلات بهداشتی است که باعث شده است مقدار آنتی­بیوتیک­های مؤثر و در دسترس، جهت درمان این عفونت­ها کاهش یافته و جامعه پزشکی را در کنترل این بیماری با مشکل روبرو نماید [۵۹].در ایران، فرانسه و تعدادی از کشورهای آمریکایی و آسیایی، مقاومت سویه­هایی از این باکتری به آنتی­بیوتیک وانکومایسین گزارش شده است [۶۴-۶۰].
اخیرا با توجه به اثرات جانبی آنتی­بیوتیک­های مصرفی و مقاومت تعدادی از سویه­های باکتری، نظیر سویه­های استافیلوکوکوس اورئوس در برابر آن­ها، به عملکرد ضد میکروبی عصاره­ها و ترکیبات طبیعی استخراج شده از گونه­ های مختلف گیاهی توجه زیادی شده است [۶۵].
۱-۶-۴ باسیلوس­ها
باسیل­های گرم مثبت اسپوردار شامل گونه­ های باسیلوس و کلستریدیوم می­باشند. این باسیل­ها در همه جا پراکنده­اند و از آن جایی که قادر به تشکیل اسپور هستند می­توانند در محیط برای سالیان متمادی باقی بمانند. جنس باسیلوس­ها شامل اشکال میله­ای شکل گرم مثبت هوازی بزرگی می­باشد که به­صورت زنجیره­ای به ­دنبال همدیگر قرار می­گیرند. بیشتر اعضای این جنس، ارگانیسم­های ساپروفیت می­باشند که در خاک و آب و هوا و بر روی نباتات شیوع گسترده­ای دارند که برای نمونه می­توان از باسیلوس سرئوس و باسیلوس سابتیلیس نام برد [۵۷].
۱-۶-۴-۱ باسیلوس سرئوس[۱۶]
مسمومیت غذایی که به وسیله باسیلوس سرئوس عارض می­گردد دو شکل مشخّص دارد، نوع استفراغ­آور که سمّ مربوط به آن در ظروف حاوی برنج بوده و نوع اسهال­زا که سمّ مربوط به آن در ظروف حاوی گوشت و سس می­باشند [۵۷]. باسیلوس سرئوس چند نوع آنتروتوکسین تولید می­ کند که مسمومیت ناشی از آن­ها از مسمومیّت ناشی از یک آلودگی غذایی بیشتر است. باسیلوس سرئوس همانند باسیل­های دیگر می ­تواند با عفونت­های کلینیکی فرصت طلب متعددی همراه شود و در اغلب موارد افتراق آلودگی سطحی با باسیل­ها از بیماری حقیقی که توسط این باسیل­ها به وجود می­آیند، بسیار مشکل است [۵۷].
۱-۶-۵ سالمونلاها
باکتری­ های گرم منفی سالمونلا تخمیرکننده لاکتوز نیستند اما متحرک و تولیدکننده گاز سولفید هیدروژن[۱۷] هستند. سالمونلاها هنگامی که از طریق دهان وارد شوند غالبا برای انسان و حیوانات بیماری­زا می­باشند. این باکتری­ ها از حیوانات و فرآورده ­های آن­ها به انسان منتقل شده و عفونت روده، عفونت منتشر و تب روده­ای (حصبه) ایجاد می­ کنند. سالمونلاها از نظر اندازه متفاوتند. اکثر سالمونلاها به­جز سالمونلا پولوروم-گالیناروم[۱۸] به وسیله تاژک­های خود حرکت می­ کنند. سالمونلاها به بعضی از مواد شیمیایی مانند (سبز برلیان، تتراتیونات سدیم و دئوکسی کولات سدیم) که بقیه باکتری­ های روده­ای را مهار می­ کنند، مقاوم می­باشند [۵۷].
۱-۶-۵-۱ سالمونلا انتریتیدیس[۱۹]
اسهال سالمونلا، شایع­ترین نوع عفونت سالمونلا است و می ­تواند توسط هر یک از ۱۵۰۰ سروتیپ، ایجاد ­شود. علائم شامل حالت تهوع، درد شکمی، اسهال به صورت آبکی و به طور ناشایع­تر حاوی موکوز و رگه خونی است. این اسهال توسط کلرایی ایجاد می­ شود که هنوز شناخته نشده است: توکسین (اسهال آبکی) و گاهی توسط التهاب ایلیال (اسهال موکوسی). درمان تنها شامل جایگزینی مایعات و الکترولیت­ها است، زیرا آنتی­بیوتیک­ها دوره بیماری­ را کاهش نمی­ دهند و باعث افزایش ریزش باکتری­ ها به مدفوع می­ شود.
۱-۶-۶ اشرشیا کلی[۲۰]
اشرشیا کلی که به ای کلای یا کلای باسیلوس معروف است، یک باکتری گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه که در سال ۱۸۵۵ توسط تئودور اشریش کشف شد. این باکتری بی­هوازی اختیاری و بدون اسپور و متحرک می­باشد. کلای باسیل قادر به تخمیر گلوگز و تولید گاز است. اشرشیا کلی معمولا جزء فلور نرمال روده می­باشد و در روده بزرگ انسان به فراوانی یافت می­ شود. این باکتری نخستین جانداری­ است که با روش­های مهندسی ژنتیک مورد دست­ورزی ژن قرار گرفت. لازم به ذکر می­باشد که برخی از سویه­های اشرشیا کلی با به دست آوردن عوامل ویرولانس از طریق عوامل ژنتیکی قابل انتقال مانند پلاسمیدها، ترانسپوزن­ها، باکتریوفاژها و لوکوس­های پاتوژنیسیتی به صورت سویه­های بیماری­زا در می­آیند. بر اساس ظهور علائم کلینیکی اشرشیا کلی­های پاتوژن به گروه­های مختلف تقسیم ­بندی می­شوند:

جهت دانلود متن کامل پایان نامه به سایت azarim.ir مراجعه نمایید.

اشرشیا کلی­های اسهال­زا

اشرشیا کلی­های پاتوژن مجاری ادراری

مننژیت و سپتیسمی

۱-۷ بررسی آنتی­بیوتیک­های مورد استفاده
۱-۷-۱ تاریخچه آنتی­بیوتیک
آنتی­بیوتیک ماده شیمیایی است که توسط گونه­ های مختلف میکروارگانیسم­ها تولید شده و با غلظت کم، می ­تواند موجب ممانعت از رشد سایر اجرام شود. اصطلاح آنتی­بیوز[۲۱] اولین بار در سال ۱۸۸۹ به وسیله ویلمین برای توجیه ماهیّت رقابتی جوامع بیولوژیک که در آن فقط قوی­ترین و اصلح­ترین، زنده می­ماند به کار برده شد و چند سال بعد این اصطلاح برای آنتاگونیسم میکروارگانیسم­ها نیز مورد استفاده قرار گرفت. کشف اولین ماده آنتی­بیوتیک به سال ۱۹۲۸ توسط الکساندر فلمینگ[۲۲] صورت گرفت. او به طور اتفاقی متوجه اثر ضد ­باکتریایی ماده مترشحه توسط قارچ پنی­سیلیوم نوتاتوم شد. هاوارد فلوری[۲۳] این ماده را تخلیص کرد و با تجویز آن موفق به درمان عفونت­ها به روش سیستمیک شد. پس از این یافته، دانشمندان مواد طبیعی دیگری را هم به عنوان آنتی­بیوتیک شامل تتراسایکلین، استرپتومایسین و سفالوسپورین به دست آوردند. پس از شناسایی ساختار این مواد توسط شیمیدان­ها، با ایجاد تغییرات در آن­ها انواع صناعی آنتی­بیوتیک­ها تولید شدند [۵۵].
۱-۷-۲ پنی­سیلین­[۲۴]
هسته اصلی پنی­سیلین ۶-آمینوپنی­سیلانیک اسید[۲۵]، یک دی­پپتید است که در آن یک مولکول والین و یک مولکول سیستئین به حالت چرخشی به هم متصل شده و یک حلقه بتا-لاکتام را تشکیل می­دهند، این حلقه به یک حلقه تیازولیدین جوش میخورد. به حلقه بتا-لاکتام، یک زنجیره جانبی با اتصال آمیدی ارتباط می­یابد. این مجموع، ساختمان اساسی کلیه پنی­سیلین­هاست که تفاوت آن­ها در زنجیرهای جانبی آن­هاست. در مورد پنی­سیلین­ها تحقیقات گسترده­ای انجام گرفته و با تغییراتی که در مولکول پنی­سیلین ایجاد کرده ­اند، تعداد زیادی مواد طبیعی یا نیمه­سنتزی[۲۶] هم­ریشه آن را پیدا کرده ­اند که برخی از آن­ها کاربرد زیادی دارند. مقاومت در برابر آنتی­بیوتیک­های بتا-لاکتام ممکن است از نظر بیوشیمیایی از راه­های زیر انجام گیرد:

غیرفعال­شدن دارو

تخریب جایگاه تأثیری

انسداد ورود دارو به داخل یاخته

مهم­ترین راه مقاومت در برابر پنی­سیلین، غیرفعال­شدن دارو به وسیله بتا- لاکتامازهاست [۵۵].
۱-۷-۳ جنتامایسین[۲۷]
این آنتی­بیوتیک را آکتینومیست میکرومونوسپرا پورپورئا[۲۸] تولید می­ کند و بر ضد طیف وسیعی از باکتری­ های گرم منفی از جمله، پزودومناس مؤثر است. این دارو همانند امیکاسین و توبرامیسین بر استافیلوکوکوس اورئوس تاثیر دارد. از جنتامایسین به همراه پنی­سیلین در درمان عفونت­های آنتروکوکسی استفاده می­ کنند ولی کاربرد جنتامایسین در عفونت­های بیمارستانی[۲۹] به واسطه افزایش اجرام مقاوم، محدودیت یافته است [۵۵]. جنتامایسین بر روی استرپتوکک­ها و باکتریویید­ها بی­اثر می­باشد [۵۷].
۱-۷-۴ تتراسایکلین[۳۰]
تتراسایکلین­ها آنتی­بیوتیک­هایی هستند که از استرپتومایسس­های مختلف استخراج شده ­اند و از نظر شیمیایی و طیف اثر ضد میکروبی مشابه یکدیگر هستند و در واقع خود خانواده­ای از آنتی­بیوتیک­های وابسته به هم بوده و در هویت چند زنجیره­ جانبی خود متفاوت هستند. اثر باکتریواستاتیکی علیه بسیاری از باکتری­ های گرم مثبت و منفی از قبیل گونه­ های بروسلا، ویبریون­ها، کورینه باکتریوم، باکتروئیدها و هم­چنین عفونت­های ناشی از کلامیدیا و میکوپلاسما دارند. با متصل­شدن به S30 ریبوزوم از سنتز پروتئین جلوگیری می­ کنند که این اتصال سبب می­ شود که دیگر آمینوآسیل-t-RNA [۳۱] نتواند به جایگاه پذیرندگی ریبوزوم ارتباط یابد و در نتیجه، از سنتز پروتئین جلوگیری می­ شود [۵۶].
۱-۷-۵ اریترومایسین[۳۲]
اریترومایسین از استرپتومیسس اریترئوس منشا گرفته و فرمول آن C37H67NO13 است. این دارو بر علیه اکثر باکتری­ های گرم مثبت، تعدادی از باکتری­ های گرم منفی از قبیل نیسریا و هموفیلوس آنفلوآنزا، اسپیرکت­ها، برخی از ریکتزی­ها و مخصوصا میکوپلاسما پنومونیه و لژیونلا پنوموفیلا مؤثر است. در ضمن این آنتی­بیوتیک، تک­یاخته­ای انگلی آنتامبا[۳۳] را از بین می­برد. ژن مقاومت باکتریایی در برابر اریترومایسین ممکن است کروموزومی و یا پلاسمیدی باشد. مقاوت پلاسمیدی که به سایر باکتری­ ها قابل انتقال است، سبب کاهش تمایل ریبوزوم برای اریترومایسین می­گردد. به نظر می­رسد که در باکتری­ ها، اریترومایسین از مرحله تبدیل جایگاه[۳۴] جلوگیری می­ کند. در این مرحله، tRNA باردار که به جایگاه دهندگی (P) ریبوزوم متصل است باید پس از برقراری پلی­پپتیدی، از قرارگاه خود آزاد شود، اریترومایسین از این واکنش جلوگیری می­ کند [۵۵].
۱-۷-۶ تری­متوپریم[۳۵] و سولفامتوکسازول[۳۶]
تری­متوپریم مهم­ترین عامل ضد اسیدفولیک است، این دارو مخصوصا به دی­هیدروفولات ردوکتاز[۳۷] باکتری­ ها متصل می­ شود و از فعالیت آن ممانعت می­نماید. دی­هیدروفولات ردوکتاز، دی­هیدروفولات را به تتراهیدروفولات احیاء می­ کند. وقتی تری­متوپریم از فعالیت آنزیم فوق جلوگیری کند، تتراهیدروفولات ساخته نخواهد شد و در نتیجه سنتز پورین­ها، پیریمیدین­ها (مخصوصا تیمین) و N-فورمیل­متیونیل-Trna مختل می­ شود و این مجموع سبب قطع رشد و سرانجام مرگ باکتری­ ها خواهد شد. در حال حاضر، مقاومت در برابر تری­متوپریم چندان زیاد نیست و بیشتر مربوط به پلاسمید است. واکنش­های جانبی تری­متوپریم مشابه سولفامتوکسازول است [۵۵].
۱-۷-۷ استرپتومایسین[۳۸]
استرپتومایسین، یکی از آنتی­بیوتیک­های آمینوگلیکوزیدی است که اثر باکتری­کشی روی تعداد زیادی از ارگانیسم­های گرم مثبت و منفی از خود نشان می­دهد. این آنتی­بیوتیک در سال ۱۹۴۴ از استرپتومایسس به دست آمد. در نتیجه قلیایی­بودن زیاد گروه­های گوانیدنو[۳۹]، استرپتومایسس تعداد گوناگونی از اثرات غیر اختصاصی را مانند خارج شدن پتاسیم از سلول یا در مقیاس بزرگتر، اگلوتیناسیون واقعی باکتری­ ها، را ایجاد می­ کند. به هر حال اثر باکتری­کشی (باکتریوسیدال) اختصاصی آن، به علت قدرت پیوند اختصاصی آن با یکی از پروتئین­های زیر واحد S30 است. این اتصال دو اثر عمده در سنتز پروتئین دارد:

باعث اشتباه قرائت پلی­نوکلئوتیدهای پیامبر (m-RNA) می­ شود.

از حرکت ریبوزوم جلوگیری می­ کند که به دنبال آن بایستی به اسیدآمینه اولین متصل گردد تا پروتئین را بسازد.

نتیجه این می­ شود که m-RNA تنها به یک ریبوزوم در محل شروع متصل شده و ریبوزوم نمی ­تواند حرکت کند [۵۶].