با بهره گرفتن از دنباله های اتصالی تسهیل کننده تخلیص پروتئین های نوترکیب می توان فرایند تخلیص را به وسیله کروماتوگرافی تمایلی در یک فرایند یک مرحله ای با خلوص و بازده نسبتا بالا انجام داد. تخلیص با بهره گرفتن از دنباله ها بسیار ساده‌تر از تکنیک های قدیمی می باشد.دنباله هیستیدینی(His-tag) و گلوتاتیونs-ترانسفراز(GST) متداول ترین دنباله‌های تخلیص می‌باشند و تخلیص پروتئین های متصل به آن‌ ها با روش کروماتوگرافی تمایلی انجام می‌گیرد. ماتریکس کروماتوگرافی تمایلی برای گلوتاتیون s-ترانسفراز گلوتاتیون و برای دنباله هیستیدینی، رزینNi2+-NTA (Ni(II)-nitrilotriacetic acid) می باشد. در دنباله هیستیدینی مزایای کوچک بودن دنباله و تمایل زیاد به یک ماتریکس کروماتوگرافی نسبتا ارزان با ظرفیت بالای اتصال و قابلیت چندین بار استفاده با یکدیگر ادغام شده اند. علاوه بر این شرایط جداسازی پروتئین جذب شده از ستون (Elution) انعطاف پذیر بوده و برای این کار نیاز به مقدار های بالا از بافر جدا کننده نیست (۲۱۸). واکنش دنباله هیستیدینی با Ni-NTA تحت تاثیر عواملی همچون نمک بالا(تا۱M) شوینده های غیر یونی (مثلTritonX-100 ویاTween20 تا۱درصد) حلال های آلی(مثل اتانل یا گلیسرول تا ۳۰ درصد) عوامل کاهنده(بتامرکاپتواتانول تا ۱۰mM) و یا شرایط دناتوره کننده (مثل۸mM اوره و یا۶mM گوانیدین هیدروکلراید) قرار نمی گیرند به این ترتیب با دنباله های هیستیدینی علاوه بر پروتئین های محلول می توان پروتئین های نوترکیب نا محلول هیستیدینه را نیز به وسیله کروماتوگرافی تمایلی تثبیت شده فلزی در شرایط دناتوره تخلیص کرد و مجددا در آن تاخوردگی ایجاد کرد (۲۱۹). رزین Ni-NTA خود نیز در رنج PH=2.5-13 پایدار است و قادر به تحمل SDS دو درصدو اتانول صد درصد است. همچنین تحت تاثیر نوکلئاز ها و یا پروتئاز ها قرار نمی گیرد بنابراین ستون مذکور می تواند به عنوان اولین مرحله تخلیص نیز استفاده گردد (۲۱۹).

 

جهت دانلود متن کامل پایان نامه به سایت azarim.ir مراجعه نمایید.

۲-۴۰- فرضیات و هدف از انجام تحقیق

 

۲-۴۰-۱ -فرضیات

۱٫ طراحی یک واکسن یونیورسال بر مبنای پروتئین L1،L2 برای پاپیلوما ویروس های انسانی
(۴۵،۳۱ ،۱۸، ۱۶،۱۱،۶،۵) شدنی می باشد.
۲٫ پروتئین نوترکیب این واکسن یونیورسال قابل تولید و تخلیص می باشد.
۳٫ تزریق این پروتئین به موش قابلیت تحریک آنتی بادی ها را دارد.

 

۲-۴۰-۲ – هدف از انجام تحقیق

۲-۴۰-۲ – ۱- هدف کلی
طراحی و ساخت واکسن کاندید یونیورسال بر علیه ویروسهای پاپیلوما انسانی (۴۵،۳۱ ،۱۸، ۱۶،۱۱،۶،۵) بر پایه پروتئینهای L1 و L2
۲-۴۰-۲ – ۲- اهداف فرعی
۱٫ طراحی یونیورسال واکسن و آنالیز بیوانفورماتیک آن
۲٫ تولید پروتئین مذکور در E.coli
۳٫ تخلیص پروتئین و ارزیابی بیان با Western Blot
۴٫ تزریق به موش و بررسی پاسخ آنتی بادی
۲-۴۰-۲ – ۳- هدف کاربردی
هدف از این مطالعه در واقع تولید یک واکسن یونیورسال برای ویروس پاپیلوما است که بتواند تیپ های مختلفی را پوشش دهد .
فصل سوم
مواد و روش ها

 

۳-۱-مجموعه توالی های پروتئین

توالی های پروتئین مرجع L1 و L2 از HPV های پر خطر شایع شامل نوع ۶، ۱۱، ۱۶، ۱۸، ۳۱ و ۴۵ است که از پایگاه اطلاعاتی http://ncbi.nlm.nih.gov بازیافت شده است. توالی L1 و L2 از HPV6 و ۱۱ بطور کامل مشابه بودند، بنابراین توالی های L1 و L2 HPV6 برای آنالیز بعدی بکار گرفته شد. این توالی ها و کدهای دستیابی به آن ها در جدول ۱ فهرست شده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Serotype L1(Accession) L2(Accession) Importance
HPV type 11 CCB84764 CCB84763 High prevalent/moderate risk
HPV type 16 AAV91691 AAO85414 High risk
HPV type 18 AAP20601 AGU90429 High risk
HPV type 31 AEI61093 AEI61092 High risk
HPV type 45 AGU90648 AGU90647 High risk

جدول۳-۱: سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV

 

۳-۲-پیش بینی اپی توپ سلول B

برای پیش بینی مناطق اپی توپ در پروتئین های L1 و L2، از سرور BCRPEDS بر اساس نقایص توصیه شده استفاده شد. این سرور سبب می شود کاربر سنجش مدل سازی را در بین سه روش پیش بینی موجود انتخاب کند: ۱) روش AAP، ۲) BCPred؛ ۳) FBCred. در سنجش پیش بینی ما، روش BCPred انتخاب شد، زیرا می توان در آن طول اپی توپ مورد نظر را انتخاب کرد و همچنین دارای اختصاصیت ارائه توالی آنتی ژنی می باشد. انتخاب اپی توپ با طول ثابت پپتید ۲۰ mers بوده است.

 

۳-۳-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال

بعد از انتخاب اپی توپ ها، در مرحله بعد از نظر میزان از قابلیت دسترسی به حلال بررسی شدند. سطح یک پروتئین می تواند بطور احتمالی با آب در تماس باشد و آن منطقۀ اتم روی سطح که بوسیله آب در تماس است، سطح مولکول قابل دسترس یا منطقۀ در معرضِ حلال نامیده می شود. بنابراین انتخاب اپی توپ های با میزان بالاتر قابلیت دسترسی به حلال توصیه می شوند. بدین منظور، به ساختمان پروتئین های L1 و L2 نیاز بود. ساختمان های کریستال پروتئین L1 و L2 قبلاً تعیین شدند. برای کسب مدل ساختمانی سه بعدی پروتئین های L1، ساختمان کریستال این پروتئین ها به عنوان قالب PDB در سرور مدل سازی پروتئین رباط Swiss Model Alignment بکار برده شد (۲۲۰). ساختمان کریستال L1 HPV 11 برای L1 HPV11، ساختمان کریستال L1 HPV 16 برای L1 HPV 16، ساختمان کریستال L1 HPV 18 برای L1 HPV 18، ساختمان کریستال L1 HPV 31 برای L1 HPV 31 و ساختمان کریستال L1 HPV 45 برای L1 HPV 45 استفاده شد. علارغم در اختیار داشتن توالی پروتئین های L2 به علت در دسترس نبودن ساختمان کریستال این پروتئین ها در قالب PDB، مدل های ساختمان سه بعدی L2 بدست نیامدند. تناسب بین مدل های ساختمان سه بعدی در SWISS-PDB Viewer توسط محاسبۀ میانگین انحراف مربع ریشه یا جذر بعد از تناسب بندی تکراری ارزیابی شد. بعد از آماده سازی ساختمان ها، قابلیت دسترسی این اپی توپ ها به حلال در نرم افزار spdbv مورد مطالعه قرار گرفت. در نهایت، اپی توپ هایی با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال انتخاب شدند.

 

۳-۴-محل های N-Glycosylated

زنجیره های کربوهیدرات در N-Glycosylation به نیتروژن آسپاراژین متصل می شوند و عملکردهای مختلفی را در بر دارند. گلیکوزیلاسیون متصل به N شایع ترین نوع پیوند گلیکوزیدی است و برای چین خوردن بعضی از پروتئین های یوکاریوتیک اهمیت دارد و در یوکاریوتیک ها رخ می دهد اما در باکتری ها نادر است. بدین منظور بیان نهایی تولید پروتئین در اشرشیا کولی طراحی شد، بنابراین حذف اپی توپ هایی که محل های N-Glycosylated دارند، ضروری است. برای پیش بینی محل های N-Glycosylated، سرور ensemblegly –Iowa مورد استفاده قرار گرفت. اپی توپ های انتخاب شده از مرحله قبلی در سرور ensembelgly –Iowa مورد انالیز قرار گرفتند و توالی هایی که حتی یک محل N-Glycosylated داشتند در طرح ساختار نهایی حذف شدند.

 

۳-۵-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان

بعد از انتخاب بهترین اپی توپ های آنالیز بیوانفورماتیک مبتنی بر L1 و L2، این اپی توپ ها به یکدیگر متصل شدند و اولین ساختمان این ساختار بوسیله سرور Lasergene Seqbuilder ساخته شد. ساختار نهایی با بهره گرفتن از ابزار ترجمۀ معکوس Sequence Manipulation Suite (http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html) ترجمه شد.Sequence Manipulation Suite یک مجموعه از برنامه های JavaScript برای آنالیز توالی های پروتئینی و DNA کوتاه است. در این سرور، ترجمۀ معکوس یک توالی پروتئینی را قبول می کند، یک جدول کاربرد کدون را برای ایجاد توالی DNA نمایش می دهد و یک توالی از همه کدون های احتمالی برای ترجمه معکوس هر اسیدآمینه به اسیدنوکلئیک را ارائه می دهد.

 

۳-۶-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon)

بهینه سازی کدون تکنیکی است که از کارایی حامل های بیان DNA که در واکسیناسیون DNA برای کسب بیان بهینۀ ژن خارجی در جسم سلول میزبان استفاده می شود، حمایت می کند (۲۲۱) . ساختارهای بهینه شده با بهره گرفتن از ابزار OPTIMIZER در سرور ژنوم که کدون مطلوب معادل با هر اسید آمینه را ارزیابی می کنند، بوسیله DNA و تعویض کدون ها کدگذاری می شوند. OPTIMIZER یک وسیله PHP on line است که کاربرد کدون یک توالی DNA را برای افزایش سطح بیان آن بهینه سازی می کند. کاربرها می توانند جداول ارجح خود را برای استفاده در فرایند بهینه سازی معرفی کنند یا از جداول از پیش تعیین شده بیشتر از ۱۵۰ گونه پروکاریوتیک تحت انتخاب با ترجمه ایی قوی استفاده کنند. این سرور می تواند برای پیش بینی و بهینه سازی بیان سطح یک ژن در بیان ژن هترولوگ با مطلوب ترین کدون مفید باشد. ارزشیابی ساختار نهایی برای آنالیز کدون نادر برای تشدید سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین یک مرحله بسیار مهم است. به این منظور، از ابزارهای آنالیز rare codon در سرور GenScript استفاده شد. این ابزار توالی DNA کدگذاری پروتئین مورد نظر را می خواند و خصوصیات مربوط به ارگانیسم آن را محاسبه می کند، این نرم افزار همچنین قابلیت تعیین CAI (شاخص انطباق کدون)، محتوای GC و توزیع فراوانی کدون را دارد. این اطلاعات برای پیش بینی این مسئله که ژن ساختمان نهایی در اشرشیا کولی به خوبی بیان خواهد شد، بسیار مفید است. CAI برای ساختمان ارتقا یافته در بهترین حالت بیان، به بالاتر از ۰٫۸ می رسد.

 

۳-۷-تولید ساختار واکسن

آنالیز نهایی ساختار واکسن مشتمل بر ۲۰ اپی توپ ۲۰ اسیدامینه ای حاوی ۴۰۰ اسید آمینه که بعد از ترجمه معکوس به صورت ۱۲۰۰ اسیدنوکلئیک در نظر گرفته شد شامل درصد احتمالی قرارگیری ساختار فوق در سطح سلول، منطقۀ آلفا آلفاتیک و بتا آلفاتیک، ترجمۀ توالی آنتی ژنیک، شاخص آنتی ژنی سیتی و پیش بینی میل ترکیبی پیوند به صورت آخرین نقطه کنترل برای اعتبارسنجی و اطمینان پذیری با روش hopp و woods در ابزار Expasy اندازه گیری شدند. نرم افزار آنزیم برش گر BamHI را برای برش ابتدای توالی و آنزیم برش گر HindIII را برای برش انتهای توالی انتخاب گردید. بنابراین، کدون آغازین ATG و توالی GGATCC (کدون BamHI) در آمینوترمینال ساختمان نهایی وارد شدند و همچنین توالی AAGCTT (کدون HindIII) نیز در کربوکسیل انتهایی وارد شد. در نهایت آنها به همدیگر متصل شدند و توالی مشاهده شد. در مرحلۀ نهایی، حامل pET28a به عنوان یک وکتور بیان پلاسمید برای ساختن واکسن مبتنی بر مولتی اپی توپ انتخاب شد. سیستم بیان p ET یکی از گسترده ترین سیستم های مورد استفاده برای کلونینگ و بیان پروتئین های نوترکیب در اشرشیا کولی در محیط آزمایشگاه است.

 

۳-۸-تهیه باکتری مستعد شده

سلول مستعد سلولی است که توانایی ترانسفورم شدن با یک قطعه DNA خارجی را داشته باشد. برخی باکتری ها در مرحله بین رشد لگاریتمی و فاز ثابت به طور خود به خود مستعد دریافت ژن می‌شوند، اما باکتری E.coli را می‌توان طی مراحلی به طور مصنوعی به سلول مستعد تبدیل کرد. به این منظور طی یک سری فرایندهای متوالی ، غشای باکتری دارای سوراخ‌های بسیار ریزی می‌شود که پذیرش DNA را آسان می کند. در این پروتوکل از کلرید کلسیم ۰٫۱ مولار استفاده می شود.