۳۰

 

 

مخلوط الحاق در °C 8 به صورت کشت شبانه انکوبه شد.
لازم به ذکر است که برای افزایش بازده واکنش الحاق باید تعداد پیکومول End محصول PCR و نیز ناقل را محاسبه و پس از محاسبه آنها را به نسبت ۱: ۳ (ناقل: محصولPCR) جهت انجام الحاق استفاده نمود. پیکومول End را از رابطه (۳-۱) زیر محاسبه مینماییم (۵۲/۰ پیکومول از قطغه هدف با ۱۷/۰ از ناقل pet-32a)

 

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

µg DNA x pmol x ۱۰۶ pg x ۱ = pmol DNA
۶۶۰ pg ۱ µg N

۳-۹-۶ جوان سازی باکتری DH5α

جهت تولید سلول‌های مستعد برای دریافت پلاسمید نوترکیب نیاز به باکتری‌های جوان می‌باشد. به‌ این منظور از استوک باکتری DH5α بر روی محیط کشت LB-آگار کشت خطی تهیه شد و به مدت ۱۶ ساعت در داخل انکوباتور با دمای °C‌۳۷ انکوبه شد. روز بعد یک پرگنه باکتری کشت داده شده به داخل ۳ میلی‌ لیتر محیط کشت LB مایع تلقیح شد و به مدت ۱۶ ساعت در داخل انکوباتور شیکر‌دار با rpm 180 در دمای °C‌۳۷ انکوبه شد.

 

۳-۹-۷ تهیه سلول‌های مستعد DH5α

۱ میلی لیتر از محیط کشت مایع DH5α (شب گذشته کشت داده شده) به ۴۹ میلی لیتر محیط کشت مایع اتوکلاو شده اضافه میکنیم و به مدت ۲-۳ ساعت در دمای °C 37 در انکوباتور شیکردار و در rpm‌۱۸۰ انکوبه شد (۶/۰OD=). سپس محلول به میکروتیوب‌های ۵/۱ میلی لیتری انتقال داده شد و به مدت ۴ دقیقه در دمای °C‌۴ و با rpm 4000 سانتریفیوژ شد. محلول بالا دور ریخته شد و به رسوب باقیمانده یک میلی‌لیتر محلول کلرید منیزیم اتوکلاو شده سرد با غلظت mM 100 اضافه شد و میکروتیوب‌ها به مدت ۳۰ دقیقه بر روی یخ قرار گرفتند. میکروتیوب‌ها در دمای °C‌۴ به مدت ۴ دقیقه و با rpm 4000 سانتریفیوژ شدند. محلول رویی دور ریخته شد و یک میلی‌ لیتر محلول کلرید کلسیم اتوکلاو شده سرد با غلظت mM‌۱۰۰ به رسوب باقیمانده اضافه شد و به مدت ۶۰ دقیقه میکروتیوب‌ها روی یخ قرار گرفتند. میکروتیوب‌ها در دمای °C‌۴ به مدت ۴ دقیقه و با rpm 4000 سانتریفیوژ شدند. سوپرناتانت را دور ریخته شد به شکلی که ۱۰۰ ماکرولیتر از کلرید کلسیم بر روی پلت باکتری حضور داشت. ۴۰ ماکرولیتر گلیسرول ۱۰۰ درصد به میکروتیوپها اضافه شده و برای نگهداری به ۲۰- منتقل ‌شد.
جهت حصول اطمینان از عدم وجود آلودگی و همچنین اطمینان یافتن از صحت عمل لیگاسیون، یک واکنش لیگاسیون دیگر به نام کنترل منفی بدون اضافه کردن قطعه رقابتگر طرح‌ریزی شد. انتظار می‌رود باکتری‌های دریافت‌کننده محصول این واکنش همگی بر روی محیط LB- آگار حاوی آمپی‌سیلین رشد نکرده و تولید کلونی نکنند. وچود پرگنه‌های سفید رنگ در محیط کشت کنترل منفی به منزله وجود آلودگی و یا بهینه نبودن شرایط هضم ناقل می باشد.

 

۳-۹-۸ انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری

ابتدا باکتریهای مستعد DH5α از فریزرºC 20- خارج شده، سریع درون یخ قرار میگیرند. مقدار۱۰ ماکرو لیتر از محصول الحاق به آن افزوده، خوب پیپتینگ میگردد.
تیوب حاوی باکتری و محصول الحاق به مدت ۴۰ دقیقه درون یخ قرار داده میشود.
پس از این زمان، برای ایجاد یک شوک حرارتی، تیوبها ۹۰ ثانیه درون حمام آب ºC 42 قرار داده میشوند.
سپس تیوب‌ها ۵ دقیقه درون یخ قرار داده میشوند.
۱ میلی لیتر از محیط کشت LB که دمای آن ºC 37 بوده و بدون آنتیبیوتیک میباشد به هرکدام از تیوب‌ها اضافه کرده، بمدت ۵/۱ ساعت در °C 37 همراه با شیک انکوبه گردید.
محیط کشت حاوی حاوی باکتری نوترکیب به مدت ۵ دقیقه با سرعت rpm4000 در دمای اتاق سانتریفوژ، مقداری از مایع رویی را خارج نموده و پلت باکتری را در باقیمانده محیط کشت حل نموده، سوسپانسیون سلولی روی پلیتهای LB حاوی آمپیسیلین که بمدت ۲۰ دقیقه در °C 37 گرم شدهاند، به دقت پخش و بمدت ۱۶ الی ۱۸ ساعت در °C 37 انکوبه گردیدند.

 

۳-۹-۹ کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب

پس از انکوبهکردن محیطهای کشت در دمای °C‌۳۷، پرگنه‌های تولید شده در محیط کشت آمپی سیلین حاوی باکتریهای نوترکیب که به اندازه کافی رشد کرده انتخاب شدند و به صورت خطی در محیط کشت انتخابی جدید به مدت ۱۶ ساعت در دمای C˚۳۷، کشت داده شدند.

 

۳-۹-۱۰ کلونی PCR

برای انجام این روش، مقدار ۵۰ ماکرولیتر آب دیونیزه استریل را در میکروتیوپ ۵/۱ ریخته و با بهره گرفتن از
لوپ، خطی از باکتری کلونی که کشت خطی داده شده برداشته و در آب دیونیزه حل شد. میکروتیوپ مزبور به مدت ۱۰ دقیقه در آب جوشانده شد. سپس سانتریفیوژ در rpm8000 انجام داده شد. از سوپر ناتانت به عنوان DNA الگو PCR استفاده شد. شرایط PCR به همان شکل که قبلا توضیح داده شده در نظر گرفته شد.
پس از تایید کلونی PCR با بهره گرفتن از پرایمر T7 در حضور ژن هدف، استخراج پلاسمید صورت گرفت. برای این منظور از محیط کشت جامدی که تک پرگنهای از کلونی‌های رشد کرده کشت داده شده بود، یک تک کلون برداشته و در محیط کشت مایع ۳ میلی لیتر کشت داده شد (۱۶ ساعت).

 

۳-۹-۱۱ استخراج پلاسمید نوترکیب

جهت استخراج پلاسمید از کیت Fermentase استفاده شد. مراحل استخراج پلاسمید با این کیت به شرح زیر میباشد:

 

 

از محیط کشت مایع به مقدار ۱۴۰۰ ماکرولیتر به میکروتیوپ ۵/۱ منتقل و سپس به مدت ۳ دقیقه در rpm 8000 سانتریفیوژ و مایع بالایی به طور کامل تخلیه شد.

۲۵۰ میکرولیتر از محلول سوسپانسیون کننده به میکروتیوب حاوی پلت باکتری اضافه و با عمل پپتینگ، پلت به طور کامل در بافر محلول شد.

همچنین ۲۵۰ میکرولیتر از بافر لیز کننده به میکروتیوب اضافه و چند بار با دست تکان شدید داده شد تا مخلوط شفاف حاصل شود.

در این مرحله ۳۵۰ میکرولیتر از بافر خنثی کننده به میکروتیوب افزوده و بلافاصله چند بار چند بار با دست تکان شدید داده شد. سپس به مدت ۵ دقیقه در rpm 14000 سانتریفیوژ گردید و مایع بالایی با دقت به میکروتیوب دارای ستون منتقل شد.

مجدداً به مدت یک دقیقه در rpm 14000 سانتریفیوژ انجام گرفت و ستون به میکروتیوب ۲ منتقل شد.

۵۰۰ میکرولیتر از بافر شستشو به ستون اضافه و به مدت یک دقیقه در rpm 14000 سانتریفیوژ شد. سپس ستون به میکروتیوب ۲ جدید منتقل و عمل شستشو تکرار گردید.

برای اطمینان از نبودن الکل بر روی ستون، ستون به میکروتیوب جدید منتقل و به مدت یک دقیقه در rpm 14000 سانتریفیوژ شد. پس از این مرحله ستون به میکروتیوب ۵/۱ انتقال یافت.

۵۰ میکرولیتر از بافر رقیق کننده، پس از اندکی انکوبه شدن در دمای C˚۴۲، بر روی ستون منتقل و در نهایت پس از دو دقیقه در rpm 14000 به مدت دو دقیقه سانتریفیوژ گردید.

پلاسمید نوترکیب استخراج شده به وسیله الکتروفورز ژل آگارز ۱% و رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید مورد ارزیابی قرارگرفت. همچنین جهت تعیین غلظت DNA نمونه ها از دستگاه نانودراپ (NanoDrop® ND-1000, USA) استفاده شد.

 

۳-۹ -۱۲ تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی

یکی از قویترین روش های تایید حضور ژن خارجی در پلاسمید هضم آنزیمی پلاسمید میباشد. بدین منظور پس از تخلیص پلاسمید به روش Mini prep هضم با دو آنزیم که جایگاه برش آنها در دو طرف قطعه هدف واقع است صورت گرفت و اندازه قطعه حاصل از برش بررسی شد. آنزیم Bam HI و EcoRI برای هضم آنزیمی مورد استفاده قرارگرفت. مواد هضم دو آنزیمی در جدول ۳-۸ آورده شده است. این مواد به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شدند.

 

جدول ۳-۸٫ مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم پلاسمید pET32a (+)-CagA

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

حق انحصاری © 2021 مطالب علمی گلچین شده. کلیه حقوق محفو